بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

Caffrey, M., Porter, C. Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (45), e1712, doi:10.3791/1712 (2010).

يوصف بروتوكول مفصلة لبلورة البروتينات الغشاء باستخدام mesophases lipidic. وقد تم هذا الأسلوب مختلفة يشار إلى المرحلة مكعب lipidic المتوسط ​​أو في الأسلوب. وقد تبين أن الأسلوب تنوعا كبيرا في أنه قد تم استخدامه ليحل الأشعة السينية البلورات هياكل من البروتينات بروكاريوتيك وحقيقية النواة ، والبروتينات التي يتم موحودي ، وطي ، ومغاير multimeric ، حامل اللون التي تحتوي على حامل اللون والخطوط ، وألفا حلزونية ، وبروتينات بيتا للبرميل. النجاحات الأخيرة في بلورة باستخدام المتوسط ​​هي الإنسان المهندسة beta2 - الأدرينالية ومستقبلات الأدينوساين A2A G البروتين يقترن. وتعرض بروتوكولات لإعادة تشكيل البروتين في غشاء mesophase monoolein مقرها ، وإنشاء التبلور في الوضع اليدوي. خطوات إضافية في العملية الشاملة ، مثل جمع الكريستال ، والتي ينبغي معالجتها في المقالات الفيديو المستقبل. الوقت اللازم لإعداد mesophase البروتين تحميل وإعداد لوحة التبلور هو يدويا حوالي ساعة واحدة.

محورا هاما في مجال البيولوجيا البنيوية والوظيفية هو الغشاء البيولوجي (الشكل 1). الغشاء الذي يحيط الخلية والعضيات الخلوية الفرعية عندما تكون موجودة ، هو بنية جزيئات الدهون رقيقة جزيئيا اثنين فقط عبر ورصع مع البروتينات. هيكل وظيفة كما ينطبق على كل من الدهون والبروتينات هي من الفائدة. ومع ذلك ، يقتصر التركيز في هذه المقالة لبروتينات الغشاء.

هو السعي إلى فهم أفضل لكيفية بروتينات غشاء الدالة على المستوى الجزيئي لسببين. أولا ، هناك ارتياح الفكرية في معرفة كيفية عملها. وثانيا ، من خلال معرفة كيف يعمل البروتين ، وهناك دائما احتمال أن تكون قادرة على إصلاح ذلك ينبغي أن عطل أو تحسين أو حتى تعديله لتطبيقات خاصة. تصميم الأدوية هو نتيجة واضحة لهذا النوع من العمل. نهج واحد لكشف كيف ان البروتين يعمل الغشاء على المستوى الجزيئي لتحديد هيكلها. وهذا ينطوي على إنشاء موقع في 3 الابعاد الفضائية لجميع الذرات ، أو على الأقل كل ذرات الهيدروجين غير ، التي تشكل البروتينات. بالطريقة التي نستخدمها لهذا الغرض هو الجزيئات البلورات بالأشعة السينية (MX). ويبين الشكل 2 مثالا على بروتين الغشاء الذي تم تحديده باستخدام هيكل MX. مطلوب نوعية الكريستال الحيود من البروتين للقيام MX.

بوضوح ، هناك العديد من الخطوات المعنية في تحديد بنية البلورات باستخدام الجزيئات. ويتضح هذا في الشكل 3. عادة ، وهذه تشمل تحديد هدف بروتين الغشاء ، ومن ثم انتاج وتنقية وبلورة ذلك. يتم إجراء قياسات حيود على البلورة به منزل أو مصدر الأشعة السينية السنكروترون. تتم معالجة البيانات حيود الغلة مخطط كثافة الإلكترونات التي يتم تركيبها بعد ذلك مع النموذج الجزيئي. النموذج ، عندما المكررة ، ويمكن استخدامها لاستكشاف آلية عمل هذا البروتين وللهيكل القائم على المخدرات تصميم

محور هذه المقالة هو لاظهار كيف ننتج جودة حيود البلورات للبروتينات غشاء mesophases lipidic به ، عن طريق ما يسمى في طريقة المتوسط. استعراض حديث عن الطريقة ونطاقه يتوفر في مرجع 1 (Caffrey ، 2009). يوصف البروتوكول خطوة بخطوة ونحن هنا سوف تتبع في مرجع 2 (Caffrey وCherezov ، 2009).

ويبين المخطط الانسيابي تلخيص الخطوات التي تنطوي عليها والوقت اللازم لإنشاء البروتين في غشاء المتوسط ​​محاكمة تبلور في الشكل 4. هذه المقالة تغطي تلك الخطوات محاطة بخطوط حمراء متقطع.

الجزء 1 : إعداد لوحات البلورة

1. موقف شريحة المجهر silanized على مقاعد البدلاء العمل.
2. إزالة الغطاء الواقي من الورق لسطح واحد شريط مثقب من ضعف العصا الشريط الفاصل (متوفرة تجاريا ، انظر الجدول من الكواشف والمعدات المحددة أدناه).
3. مكان الشريط ، جنبا إلى أسفل لزجة ، في اتصال مع سطح الشريحة.
4. الضغط ختم الشريط إلى الشريحة باستخدام براير أو الدوارة. يمكن وضع رقائق الألومنيوم بين الشريط والأسطوانة لحماية القاعدة من الآبار.
5. إزالة الغطاء الورقة الثانية من الشريط لفضح سطحه العلوي لزجة.
6. مكان coverslips silanized الفردية على مقربة من لوحة لمنع تسرب بسرعة وكفاءة الآبار بمجرد اكتمال التحميل.

الجزء 2 : إعداد الحقنة الدهن

1. ضع الدهن (غالبا monoolein) في كتلة التحكم في درجة حرارته الى 45 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لجعله المنصهر.
2. في حين أن الدهن يذوب إعداد two - 100 ميكرولتر الغاز محكم المحاقن هاميلتون لاستخدامها في خطوة البروتين الدهني الاختلاط. إزالة الطويق تفلون من الحقنة التي تحتوي على البروتين حل. مكان الحقنة التي ستعقد في الدهون بجانبه (ترك الطويق رصيده في المركز).
3. توصيل الهيدروليكي (انظر الجدول من الكواشف والمعدات المحددة أدناه ، ومرجع 3 (تشينغ وآخرون ، 1998)) لحقنة الدهون. الإصبع تشديد مقرنة إلى حقنة ولكن لا أكثر من تشديد. إزالة المكبس من فوهة المحقنة الدهون.
4. علما بأن المادة الدهنية يجب المنصهر قبل المتابعة. تعيين إلى 30 ميكرولتر ماصة واتخاذ ببطء نحو 30 ميكرولتر من الدهن المنصهر. تقدم ببطء أكبر قدر من الدهن المنصهر كما يمكنك في النهاية المفتوحة للحقنة مع الحرص على عدم إدخال الهواء الثغرات.
5. وضع المكبس في برميل في اتصال مع والدهن المنصهرة يتقدم ببطء حتى الغطاس للبرميل مع حقنة عقد عموديا كما هو موضح في الفيديو. وينبغي أن فقاعات الهواء التي قد تكون عن غير قصد محاصرين ارتفاع في العملية ، والإفراج عنهم.
6. تحديد دقيق لحجم الدهون في حقنة من خلال قراءة علامات على برميل حقنة.
7. حرك ferrالندبة على الإبرة تمتد من مقرنة. استخدام المكبس لإجبار الدهن المنصهر فوق برميل وببطء وبلطف في إبرة في جوهر مقرنة.

الجزء 3 : إعداد الحقنة البروتين

1. وينبغي أن نسج الحل البروتين في 14000 ز لمدة 5 إلى 10 دقائق في 4 درجات مئوية لإزالة الركام كبيرة قبل إعداد محاكمات التبلور. الحل إزالة البروتين من الجليد والسماح لها لكي تتوازن في درجة حرارة الغرفة.
2. حساب حجم من محلول البروتين لاستخدامها في شكل مكعب في مرحلة قريبة من الماء أو الكامل. لmonoolein عند 20 درجة مئوية ، والترطيب الكامل مع الماء يحدث في المياه ما يقرب من 40 ٪ (حسب الكتلة) كما في الرسم البياني المرحلة ⁵ (الشكل 5).
3. حقنة مع 25 أو 50 ميكرولتر هاميلتون مضاعفة حجم المطلوب من حل البروتين. نقل الحل على طرف من تفلون الغطاس في برميل من الحقنة البروتين مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء.
4. سحب الإبرة بعناية وقياس حجم محلول البروتين في المحاقن. يجب أن تتطابق القيمة التي ألقيت في الخطوة السابقة.
5. بوصة ببطء الحل البروتين تصل للبرميل في نهاية المطاف مع تدفق نهايتها مفتوحة.
6. المسمار المحقنة البروتين في النهاية المفتوحة للمقرنة تعلق على حقنة الدهون. فمن الأهمية بمكان أن الجهاز لا يمكن تشديد مفرط. الإفراط في تشديد سيقوم الجهاز تجميعها الاختلاط في هذه المرحلة إلى تلف الحلقات ويسبب تسرب. وتحت شد أيضا أن تؤدي إلى تسريب المعلومات.

الجزء 4 : محلول البروتين والدهون خلط : جعل Mesophase

1. لإحداث خلط ودفع المكبس على الجانب البروتين وحدة خلط تجميعها إلى أقصى حدوده ، مع الإبهام أو السبابة القيادة الحل للخروج من البروتين حقنة البروتين ، عن طريق وصلة الربط في حقنة الدهون.
2. يستخدم الآن الغطاس على الجانب الدهون إلى محرك محتويات الحقنة الدهون مرة أخرى من خلال وصلة الربط في حقنة البروتين.
3. يتم تكرار العملية مرات عديدة ، في بعض الأحيان ، ويتطلب مئة او اكثر المقاطع لإنتاج mesophase متجانسة. في بداية الاختلاط ، ويمكن أن تكون حركة المواد جيئة وذهابا عبر مقرنة متفاوتة ، وأحيانا ، هناك حاجة لقوات اضافية تأثير الاختلاط. ويرافق عادة خلط الأولي وضع الغيوم غير موحدة في العينة. كما تقدم التجانس ، والملمس ، ويصبح أكثر تجانسا من سمات المرحلة مكعب لزجة ، كما يفعل المظهر المرئي للmesophase مكعب الناشئة.
4. إذا كانت الظروف ملائمة والأشكال المرحلة مكعب ، وينبغي أن تشتت تظهر شفافة بصريا في برميل حقنة. وبالتالي ، ينبغي أن علامات على برميل حقنة يكون مقروءا بوضوح من خلال mesophase في برميل.
5. يمكن تبريد طفيف للغاية من خلال عينة عن طريق وضع خلط خالط حقنة لفترة قصيرة على الجليد تسريع التجانس وتحقيق الشفافية. ومع ذلك ، فمن المهم ألا overcool العينة.
6. وينبغي الحرص على تجنب خلط قوية للغاية ، حيث أن هذا يمكن أن يسبب ارتفاع درجة حرارة العينة إلى التدفئة بسبب الاحتكاك ^3.

الجزء 5 : تحميل والصيدلي

1. إزالة الإبرة والمكبس من المحاقن وهاميلتون 10 ميكرولتر. مغادرة الطويق تفلون في المكان.
2. إزالة الجوز من الاحتفاظ موزع مع المعونة لعملة واحدة صغيرة.
3. مع الذراع اسئلة انسحبت بالكامل ، تضاف حقنة -- من دون المكبس والإبرة -- من خلال عقد حلقة للموزع.
4. استبدال الجوز استبقاء ، طوقا الجانب التي تواجه المحاقن ، والمسمار في بإحكام على النهاية المفتوحة للحقنة.
   وينبغي الحرص على ضمان ويتركز بشكل صحيح حقنة في حلقة القابضة والتي يتم محاذاة موازية للبرميل الذراع اسئلة. ويمكن الحكم على حد سواء عن طريق العين. هذين المطلبين حاسمة لتجنب تسرب.
5. الغواص من خلال تمرير الحلقة التي تجتاح مع الجوز القابض مفكوك a قليلة ويتحول دليل الغطاس في النهاية المفتوحة للحقنة. اسئلة خفض الذراع بالكامل. تحريك المكبس في برميل وتحقق أنه يسافر بحرية وحقيقية في برميل. فإنه قد يساعد على تخفيف المسمار على شريط دليل لتسهيل المكبس يتحرك بحرية. تأكد من أن يفعل. كساد الغطاس حتى في تفلون غيض محاذاة مع علامة الصفر على التخرج ميكرولتر برميل. إذا كان خففت المسمار على شريط دليل ، إعادة إحكام عليه وإعادة فحص أن المكبس يتحرك بحرية.
6. تحريك المكبس على جانب واحد من وحدة خلط تجميعها لعلامة الصفر ميكرولتر التخرج لنقل mesophase إلى حقنة أخرى ومقرنة لل.
7. افصل حقنة فارغة (مع الطويق رصيده في المركز) من وحدة الخلط والاتصال على الفور حقنة تحميل -- مع مقرنة attached -- لإنهاء مترابطة من الحقنة الاستغناء عن 10 ميكرولتر. درجة ضيق التي يتم اقتران أمر بالغ الأهمية ، كما لوحظ بالفعل.
8. تحميل حقنة الاستغناء بالضغط على المكبس من المحاقن 100 ميكرولتر بحيث mesophase التحويلات من خلال مقرنة.
9. تأمين قصيرة ، شقة ذات الرؤوس الإبرة إلى إنهاء الصلب من الحقنة الاستغناء بعناية وإحكام تثبيته في مكانه.
10. المشبك المكبس إلى ذراع اسئلة من خلال تشديد الجوز في الحلقة التي تجتاح. وينبغي الحرص على عدم المبالغة في تشديد المكسرات ، وهذا يمكن أن يسجل وتشويهه الغطاس جعلها غير صالحة للاستعمال. فمن المهم أن تكون محدودة النطاق السفر المقدمة للذراع اسئلة في حالة فرضت إلى ما لا يزيد عن شبر واحد ، كما هو موضح في الفيديو. أبعد من ذلك ، فإن المكبس لديهم ميل إلى الرضوخ والتسليم يمكن أن تفشل.
11. كساد طبل اسئلة عدة مرات لدفع المكبس في برميل ، وبالتالي سد الفراغ من حجم الإبرة وتحميل الإبرة. وينبغي تكرار هذه الخطوة (ما يصل الى عشر مرات) حتى سلسلة متواصلة من mesophase يخرج من رأس الإبرة.
12. وينبغي أن تبدأ المحاكمات تبلور على الفور ، لأن بعض البروتينات غير مستقرة في المرحلة مكعب دون مرسب المضافة.

الجزء 6 : إعداد لوحات البلورة

1. وضع لوحة متعددة التبلور بشكل جيد وساترة على سطح أثار بضع بوصات فوق مقاعد البدلاء العمل لتسهيل التحميل. وتتحقق على النقيض الأمثل وتعزيز الرؤية عند السطح مظلم قليلا.
2. التجانس الحلول مرسب وانزع غطاء قنينة. تعيين الماصة الاستغناء مرسب إلى 1 ميكرولتر.
3. مع حقنة الاستغناء عقد عموديا في يد واحدة ، واستخدام اليد الحرة لموقف الطرف إبرة في الوسط ومباشرة فوق قاعدة جيدة عدد 1. اضغط على الزر الموجود على موزع لتكرار طرد بلعة mesophase من على سطح الزجاج. حجم بلعة هو 200 NL عند استخدام موزع القياسية مع تكرار حقنة 10 ميكرولتر. يجب أن رأس الإبرة يكون هناك أكثر من بضع مئات ميكرومتر فوق قاعدة جيدة لضمان تسليم السليم.
4. بعد أن يتم تحميلها 4 آبار مع mesophase المجاورة ، ومكان 1 ميكرولتر من محلول مرسب على رأس كل بلعة mesophase باستخدام الماصة 2 ميكرولتر ونصائح المتاح القياسية.
5. بأسرع وقت ممكن ، وضع ساترة تماما على الآبار لتغطية شغل لهم بانتظام. لتأثير المياه ختم محكم ، واستخدام ملعقة لممارسة الضغط على ساترة حيث أنه يجعل الاتصال مع سطح لزجة المكشوفة من الشريط الفاصل.
6. يمكن أن يتكرر في mesophase ومرسب عملية الاستغناء حتى يتم تحميل جميع الآبار على لوحة ومختومة.
7. التسمية لوحة واضحة لتتبع الأغراض. وعادة ما يتم التعامل مع البروتينات الحساسة للضوء عن طريق الالتفاف على لوحات في رقائق الألومنيوم قبل وضعها في غرفة الحضانة.
8. وضع لوحات في غرفة التحكم في درجة حرارته ، وعادة عند 20 درجة مئوية.
9. على جدول منتظم ، وفحص الآبار لنمو البلورات باستخدام مجهر الضوء المستقطب مع الهدف 10 أو 20 ضعفا. جدول المستخدمة في المختبر المؤلف على النحو التالي : اليوم 0 ، 1 ، 2 ، 3 ، 5 ، 7 ، 14 ، 21 ، 30 و 60 بعد انتهاء الإعداد. تفتيش دقيق للبلعة mesophase ضبط عمق التركيز داخل العينة 0،14 ملم سميكة. وينبغي أن يتم الفحص في كل من الضوء الطبيعي وبين عبرت - المستقطبات.

الجزء 7 : النتائج الممثل

مظهر البلورات الناتجة سوف تختلف مع اللون الأصيل من البروتين الغشاء ، واستقطاب الضوء المستخدمة للتفتيش (أو عدمه) وطريقة ونوعية الإضاءة. ويبين الشكل 6 عدة مظاهر الكريستال ممكن. يمكن أن بروتينات غشاء الملونة طبيعيا نموا في المتوسط ​​عند عرضها مع الضوء العادي تبدو مثل تلك التي تظهر في الشكل 6 (ب ألواح ود). عديم اللون يمكن أن بلورات البروتين غشاء نموا في المرحلة مكعب عند عرضها مع الضوء العادي تبدو مثل تلك التي تظهر في الشكل 6 (الفريق ه). أخيرا ، يمكن للبلورات عديمة اللون بروتين الغشاء نموا في المتوسط ​​عند عرضها مع الضوء المستقطب تبدو الشكل 6 (ألواح ألف وجيم).

الخطوات التالية في العملية الشاملة لتحديد هيكل أن الحصاد والبرد وبلورات بارد لتسجيل وتحليل حيود الأشعة السينية منها. هذه المواضيع هي التي يجب تغطيتها في المادتين إن الرب منفصلة.

وتقع الشكل 1. تمثيل تخطيطي للغشاء البيولوجية تظهر طبقة ثنائية المادة الدهنية والتي في مجموعة متنوعة من البروتينات.

الشكل 2. هيكلمن فيتامين ب ₁₂ BtuB نقل ، والبروتين ، وحلها باستخدام MX البلورات التي يزرعها في المتوسط ^​​6 الأسلوب هو موضح في هذا المقال إن الرب.

الشكل 3. دورة البنية الدالة ويوضح العديد من الخطوات المتبعة في الحصول على المعلومات والاستفادة من هيكلية كاملة حول بروتين.

الشكل 4. انسيابي ويلخص الخطوات المتبعة في إنتاج بلورات البروتين من الغشاء في أسلوب المتوسط. لا تغطي سوى تلك الخطوات محاطة خط أحمر متقطع في هذه المقالة إن الرب. من مرجع 2.

الشكل 5. مبسطة مخطط المرحلة درجات الحرارة لتكوين الدهون (monoolein) / نظام المياه. يتم تعيين محاكمات تبلور تصل حتى 20 درجة مئوية حيث الدهون المشبعة بالماء في الماء 40 ٪. المخطط المرحلة التفصيلية المتاحة في مرجع 5.

الشكل 6. بلورات من بروتينات غشاء نموا في mesophase lipidic.
(أ) فيتامين ب ₁₂ البروتين نقل وBtuB ⁶ ، (ب) للضوء حصاد معقدة الثاني ⁷ ، (ج) OpcA adhesin / الإنفازين ⁸ ، (د) رودوبسين جرثومي ⁹ ، (ه) نقل من الكربوهيدرات الزائفة. الصور المسجلة مع الضوء العادي (ب ، د ، ه) وبين مستقطب (أ ، ج).

المرحلة مكعب هي بيئة حساسة وحيوية يمكن أن تغير جذريا مع تغيير عدد من المتغيرات. ليس من الممكن أن يقدم وصفا من الإعداد للمحاكمات في المتوسط ​​في بلورة الوضع اليدوي الذي يصف كل المزالق المحتملة. ومع ذلك ، يمكن تجنب العديد من الصعوبات من خلال ممارسة هذا الأسلوب قبل تطبيقه إلى حلول مكلفة والبروتين باستخدام الاعتدال في الضغوط التي مورست على الحقن خلال عملية الخلط. عمله بشكل صحيح ، في أسلوب المتوسط ​​يمكن أن تسفر عن بلورات من طائفة واسعة من البروتينات ، وعدد الذي يتزايد باستمرار.

وتركز على الوصف الوارد هنا من الإعداد للمحاكمات في التبلور المتوسط ​​على الوضع اليدوي. يمكن أن تكون العملية ، وغالبا ما يتم تعديل لتسهيل الإعداد الآلي لوحات تبلور في تلك الحالات التي تتطلب الفحص واسعة النطاق للظروف التبلور.

هناك العديد من الذين ساهموا في هذا العمل ، ومعظمهم من الغشاء Caffrey الهيكلية والوظيفية مجموعة البيولوجيا ، وهما عضوان في الماضي والحاضر. لجميع نتقدم بأحر الشكر والتقدير. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم ايرلندا (07/IN.1/B1836) ، والمعاهد الوطنية للصحة (GM75915) ، وجامعة ليميريك.

1. Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
2. Caffrey, M. & Cherezov, V. Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
3. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H. & Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids 95, 11-21 (1998).
4. Cherezov, V. & Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
5. Qiu, H. & Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials 21, 223-234 (2000).
6. Cherezov, V., et al. In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution. J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).
7. Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M.Z. & Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
8. Cherezov, V., et al. In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin. Proteins 71, 24-34 (2008).
9. Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y.F. & Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.