ヒト表皮再構築モデルを用いたインビトロ皮肤刺激试験

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I.ティッシュコンディショナー - 0日目

1. 表皮EPI - 200 - SITのキットを受け取ると、（キットの詳細については、特定の試薬と機器の表を参照）整合性のためにすべてのキットコンポーネントを確認してください。
2. 、3表皮組織、ある滅菌6ウェルプレートアッセイ培地0.9 mlをあらかじめ入力して準備する。
3. 無菌条件下で、表皮の組織を含む24ウェルプレートを含むビニール袋を開いて、滅菌ガーゼを取り除く。
4. 表皮の組織を含む各インサートを削除し、空の24ウェルプレートのインサートを配置するために滅菌ピンセットを使用してください。このステップの間、滅菌濾紙上にブロッティング穏やかでインサートの外側に付着している残りの出荷アガロースを削除します。
5. 次の5分以内に、視覚的に組織を検査する。完全に液体で覆われている欠陥のある組織や組織を使用しないでください。
6. 滅菌綿棒の綿棒を使用して、慎重に組織の表面を乾燥させる。直接組織に触れないようにしてみてください - 毛細管効果は、組織表面から水分を除去するのに十分です。
7. 組織表面を乾燥した後、6ウェルプレートアッセイ培地0.9 mLであらかじめ入力の一番上の行に3つの組織を移す。インサートの下に閉じ込められた気泡を離します。
8. 60用インキュベータへの挿入を含む6ウェルプレートを置き± 37℃で5分間プレインキュベーション± 1℃、5 ± 1％CO _{2、95％RH（}相対湿度）。
9. 60 ± 5分間プレインキュベーション期間の終了時に、6ウェルプレートの下側​​のウェルに上限井戸から挿入して転送する。バック一晩プレインキュベーション（18 ± 3時間）のためのインキュベーター（37 ± 1℃、5 ± 1％CO _{2、95％RH）}にプレートを置きます。
10. 冷蔵庫（5 ± 3℃）にアッセイ培地の残りを置きます。プレインキュベーション一晩続いて、被験物質は、表皮の組織に適用することができます。

    注：プレインキュベーションの手順は、後半に組織の配信の場合（組織が ​​水曜日の代わりに火曜日に到着する場合など）に短縮することができます。

II。化学物質の曝露 - 1日目

1. わずか0.9 mlあたりウェルのアッセイ培地で上段を充填することにより被験物質ごとに、6ウェルプレートを準備します。
2. 約5分の化学物質への計画的な露出の前に、インキュベーターからプリエアコン組織を含む6ウェルプレートを取り外します。
3. 組織の面を評価し、滅菌綿のヒントを使用して水分を取り除く。
4. 試験物質のコードや名前を持つすべての6ウェルプレートの蓋にラベルを付けます。
5. 投与量1分間隔で被験物質を有する組織は、曝露後の被験物質の洗浄容易にする。最後の組織が投与されるまで、無菌フード内投与された組織でプレートを保管してください。
6. 液体化学薬品をテストするには、直接組織の上に溶液30μLを分注し、組織の表面にナイロンメッシュを配置。必要に応じて、そっとガラスパスツールピペットを率いる電球を使用してメッシュを配置します。組織表面に押さないでください。
7. 半固体をテストするため、直接組織の上に30μLを分注するために容積式ピペットを使用してください。パスツールピペットを持つ化学物質は、可能な限り組織の表面をカバーするために必要なスプレッド場合。
8. 固体材料の場合は、すぐに被験物質の適用前に、滅菌DPBSの25μLを組織表面を湿ら。これは、被験物質による組織表面の接触が改善されます。細かく粉砕された試料の約25 mgの25 mgのキャリブレーション鋭いアプリケーションのスプーン（または他の適切なツールを）埋める。組織表面に固体の被験物質を適用します。必要に応じて、完全にスプーンを空にするパスツールピペットを率いる電球を使用してください。ゆっくりと表面に固体の拡散を改善するために挿入を振る。
9. ろう状の粘度を持つ被験物質の場合は、直径で約8mm作品フラット"のようなクッキー"を形成し、以前に滅菌DPBSで濡らしていた組織、頂上に配置してみてください。被験物質と組織との間の接触を改善するために、ステンレス製またはプラスチック製の助けを借りて、"クッキー"を下に重量を量る。
10. 陰性コントロールとコントロールの組織に陽性対照として5％SDSなどのDPBSを適用します。
11. 最後のティッシュを投与した後、加湿インキュベーター（37 ± 1℃、5 ± 1％CO _{2、95％RH）。}ために35のすべてのプレート± 1分を転送
12. 35後の± 37℃で1分間のインキュベーション℃のインキュベータからのすべてのプレートを取り外す。ナンプラーを配置無菌フードにTESと60分の期間、化学物質暴露が最初に投与された組織のために完了するまで待ちます。
13. その後（すべての挿入のための総露光時間が60分であることを保証するために）分の時間間隔ごとにインサートを使用して洗浄操作を開始します。
14. 滅菌DPBSで組織を洗浄する洗浄瓶を使用してください。 DPBSの定数ストリームを使用して15回インサート組織を記入し、（注、それを空にする：。ナイロンメッシュを有する組織のために、組織の表面を5回洗浄し、先の尖った、鋭いピンセットで慎重にメッシュを削除するには、その後、残りを続行10回洗浄）。
15. 15日以降に150mlのDPBSで完全に水没挿入3回、洗浄瓶を用いて洗い、試験材料の残りの部分を削除するには振る。
16. 最後に、滅菌DPBSで一回内側からと一度外から組織のインサートをすすぐ。
17. 優しくインサートを振って、滅菌吸い取り紙の上にブロッティングにより組織からDPBSの余分を削除します。
18. 以前にアッセイ培地であらかじめ入力された新しい6ウェルプレートにブロット組織のインサートを移す。これらの手順はすべて、（14-18）、挿入のたびに1分以内に行う必要があります。
19. 最後の組織をリンスした後に、慎重に滅菌綿棒をチップソーで各組織の表面を乾燥させる。
20. 次の24 ± 2時間（37 ± 1℃、5 ± 1％CO _{2、95％RH）}のためにインキュベーターで組織をインキュベートする。

    注：各アッセイの技術者は、下記のようにプロトコルに従うことができるように、単一のテストラン（セット）での陰性および陽性対照を含めて7つ以上の試験物質をテストしてはいけません

III。培地の交換 - 2日目

1. 24 ± 2時間後のインキュベーションの後、6ウェルプレート、メディア0.9 mlを事前に満たされたの下部に挿入して転送する。上段からのメディアは、追加のエンドポイント（サイトカイン、ケモカインなど）の分析用に収集することができます。二次エンドポイントの解析は任意です。
2. ポストインキュベーションを続行します（37 ± 1℃、5 ± 1％CO _{2、95％RH）}さらに18 ± 3時間。

IV。 MTT生存率アッセイ - 3日目

1. ラベル化学物質名またはコードを持つ2つの24ウェルプレート。一つのプレートには、MTTと抽出工程のための他に組織のインキュベーションのために配信されます。
2. MTT濃縮物（5 mg / mL）を解凍し、MTTの希釈剤で希釈してMTT溶液を調製します。 MTT溶液の最終濃度は1 mg / mlである。
3. ピペット24ウェルプレートの各ウェルにMTT溶液を300μL。
4. インキュベーターから6ウェルプレートを取り外す、吸い取り紙でインサートの底面を覆い隠す、そしてMTT付きプレフィルド24ウェルプレートにそれらを転送する。
5. インキュベーター内で24ウェルプレートを配置する（37 ± 1℃、5 ± 1％CO _{2、95％RH）}と3時間インキュベート± 5分。厳密に3時間を厳守±異なるMTTの測定値との偏差を避けるために5分のインキュベーション時間を。
6. MTTのインキュベーションが完了すると、静かに全ウェルのMTT培地を吸引する吸引ポンプを使用してください。
7. リフィルは、DPBSで井戸と再び吸引。この洗浄をさらに2回繰り返し、組織の最後の吸引後乾燥していることを確認してください。
8. 洗浄後、新しい24ウェルプレートにインサートを移す。軽く各インサートに2 mLの抽出液（イソプロパノール）をピペッティングすることによって、挿入を浸し。レベルは、このように完全に組織を水没、インサートの上端よりも高くなります。
9. 抽出剤の蒸発を抑制するために24ウェルプレートを（パラフィルムやシール袋を使用する場合の例）封印。プレートシェーカー（約120回転）で静かに撹拌しながら室温で少なくとも2時間のために組織からMTTを抽出する。振盪せずに一晩抽出を使用することもできます。
10. 抽出期間が完了したら、ピアス注射針や電球パスツールピペットをビーズと抽出液が、挿入が取得されたウェルに実行できるようにすると挿入。
11. パンクしたインサートを破棄し、それが均一になるまで上下に三回ものソリューションをピペット。
12. それぞれの組織の場合は、96ウェル平底マイクロタイタープレートに紫色のホルマザンのソリューションの2つの200μLのアリコートを移す。このビデオプロトコルに付随するスプレッドシートで指定された固定プレートのデザインに応じて複製を転送する。ブランクの場合は、イソプロパノールを使用してください。
13. 基準フィルタなしで570 nmの（540〜580）の波長を用いて96ウェルプレート分光光度計でMTTの抽出物の光学密度（OD）をお読みください。
14. 結果の自動計算（図1）のためのスプレッドシートに結果を入力してください。
15. 被験物質は、"IRRIラベルが付けられています重要"（R38またはGHSカテゴリ2）MTTアッセイによって決定されたパーセントの組織の生存率は陰性対照に対する相対的な<50％の場合。
    

    注：MTTは有毒なので、取り扱う際には必ず手袋を着用してください。 MTTは光に敏感であるため、光からMTTとそのソリューションを保護する。それは時間の経過とともに低下するので、調製後数時間以内にMTT溶液を使用してください。

V.アッセイの品質コントロール

• 表皮EPI - 200 - SITキット承認基準：

  体外 RHEモデルではなく、検証のプロセス^（8）中、時間をかけて一貫性のある、高品質なデータを提供する必要があります。長期的なアッセイの再現性とパフォーマンスを確保するために推奨されるガイドラインは、"パフォーマンスのための各ロットのサンプリングを細胞または組織の完全な特性、...、及びアッセイのパフォーマンスの一貫性の保証を提供するコントロールとベンチマーク化学物質の定期的な使用^"（9）が含まれ。以下に概説するアッセイの受け入れ基準に加えて、表皮の各製造ロットは、追加のベンチマークの化学物質（1％トリトンX - 100）に対して製造業者によってテストされた品質管理です。トリトンX - 100の50％（ET - 50）に組織の実行可能性を減らすために必要な露光時間が決定されます。表皮の場合は、年平均ET - 50値は5.9時間から7.5時間であったしている。ネガティブコントロール組織のための多くのCV（ベースラインの生存率の変動性をすなわち）の多くは、1996年から毎年7.5％の下に平均しています。順番に各製造ロットのET50値は、（上限許容限界= 8.7h;下限許容限界= 4.8h、すなわちET - 50 = 6.7時間）、1996年に設立された歴史的な平均的なトリトンX - 100 ET50の2標準偏差内に収まっている必要がありますメーカーによる使用のためにリリースされる。

• EPI - 200 - SITアッセイ受け入れ基準1：ネガティブコントロール：

  MTT試験でネガティブコントロール（NC）組織の絶対的なODは（滅菌DPBSで処理）の手順を出荷し、保管した後や特定の使用条件下での試験所で得られた組織の生存能力の指標です。 NC組織の平均OD _570は ≥1.0と≤2.5の場合アッセイは、受け入れ基準を満たしています。

• EPI - 200 - SITアッセイ受け入れ基準2：ポジティブコントロール

  5％SDS（H ₂ O中）ソリューションは、ポジティブコントロール（PC）として使用し、被験物質と同時にテストされています。 PCは、それぞれのアッセイで試験することではなく、複数のPCが一日のテストごとに必要とされていることを同時手段。陽性対照の生存率は、過去のデータの95％信頼区間内にある必要があります。ネガティブコントロール組織の％として表されるPCの組織の平均生存率が20％の場合、アッセイは、受け入れ基準を満たしています。

• EPI - 200 - SITアッセイ受け入れ基準3：標準偏差（SD）

  皮膚刺激性は、3つの組織で決定されるため、組織の変動が許容可能な低いはず複製、平均生存率から予測される。同じ3個％の組織の生存率から算出したSDが複製処理された場合アッセイは、受け入れ基準を満たしている<18％である。

代表的な結果

このビデオでは、我々は表皮の皮膚刺激性試験（表皮SIT）を開発し、化粧品及び医薬品成分を含む化学物質のin vitroでの皮膚刺激性試験のための検証を実証した。プロトコルからの逸脱が異なる結果を引き起こす場合があるので、このメソッドを実行するとき、それは、無菌条件下で動作するようにし、厳密に検証プロトコルに従うことが重要です。アッセイのいくつかの変形が可能である、しかし、プロトコルへの変更は、著者と直接相談する必要があります。

この方法の唯一の制限は、MTTのエンドポイントとの被験物質の干渉の可能性があります。直接MTTを減少させる色の被験物質または1つの（そしてそれによって細胞のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性を模倣するには）MTTエンドポイントを妨げる可能性があります。しかし、これらの被験物質は、まだ（またはで）で組織を提示している唯一のMTT試験（すなわち42時間被験物質の暴露後の）被験物質の十分な量の時の場合の問題です。この万一の場合には、着色された試験物質や試験材料による（false）を直接MTTの還元により（本当の）代謝MTTの還元と貢献はで提供されるアッセイの標準操作手順で詳しく説明されている手順によって定量化することができるマテック株式会社

著者らは、変性表皮^SIT（5の多施設国際検証研究に参加するためBfRは（ドイツ）、BASF SE（ドイツ）、IIVS社（米国）、ゼットイン- LSL（オーストリア）でZEBETに感謝したいと思います^）。

1. Kandárová H., Liebsch M., Genschow E., Ingrid Gerner, Traue D., Slawik B., Spielmann H.: Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests. ALTEX, 21, 3/04, 107-114 (2004).
2. Kandárová , H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H.. EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test. ATLA, 33 (4), 351-367. (2005).
3. Kandárová H., Hayden P., Klausner M., Kubilus J., Kearney P., Sheasgreen J. In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication in ATLA (2009). Abstract In: Toxicology Letters, Abstracts of the 44th Congress of the European Societies of Toxicology Volume 172, Supplement 1, 7, Page 81 (2007).
4. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová , H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA, 35, 559-601 (2007).
5. Liebsch M., Gamer A., Curren R., Frank J., Genschow E., Tharmann J., Remmele M., Bauer B., Raabe H., Barnes N., Hilberer A., Wilt N., Lornejad-Schäfer MR., Schäfer C., Spiller E., Hayden P., Kandárová H. : Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, Septemner 19-21.Linz, Austria. In: ALTEX, Volume 25, Supl 1 Linz/2008, ISSN 0946-7785 1-100, 43. (2008) (manuscript in preparation).
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   Available: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]
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9. Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M.: Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice. Regul Toxicol Pharmacol. Jul;45(2):97-103 (2006).

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