하와이 밥테일 오징어에서 Hemocytes 구하기 Euprymna scolopes와 공생이 아닌 공생 박테리아들의 준수를 관찰

1. 0.22 μm의 필터 살균 인공 해수 500 MLS (; 염도 35 PPT F​​SW)를 준비합니다. 0.22 μm의 미크론 필터를 통해 필터 인공 또는 자연 해수는 입자와 세균을 제거합니다.
2. FSW의 에탄올의 2 % 용액에 배치하여 한 성인 하와이 밥테일 오징어 (Euprymna scolopes)을 마취. 약 10 분 동안 마취에서 동물을 놓으십시오. 오징어 수영을 중지하고 적극적으로 터치에 응답하지 않습니다. 계속 호흡, 맨틀의 움직임에 의해 표시하고, chromatophore 활동은 계속 관찰하여야한다.
3. 표준 왁스 절개 트레이에 직면 복부 측면과 오징어를 넣으십시오. FSW 2 %의 에탄올을 포함하는으로 동물 잠수함.
4. 하나의 표준 200 μl 피펫 팁을 사용하여 깔때기와 두 눈 사이에있는 주요 두부 혈관을 폭로 맨틀 다시 가져옵니다.
5. 26.5 - 게이지 바늘, 바늘 두개의 혈관과 hemolymph의 50-100 μl 사이의 철회와 살균 한 ML의 주사기를 사용하여. 얼음 멸균 1.5 ML 튜브의 hemolymph를 놓습니다.
   참고 : 동물 기증​​자 여러 번 역할을한다면, 오직 주어진 시간에 hemolymph의 10-20 μl를 철회. 일반 해수 탱크에 동물을 반환합니다. 동물은 30 분 이내에 회복됩니다.
6. 갓 수집 hemocytes는 오징어 링어의 솔루션 (; 530 MM NaCl, 10 MM KCl, MgCl ₂ 25 MM 10 MM CaCl ₂ 10 MM HEPES 버퍼, 산도 7.5 S - 링거스) 500 μl에 씻어 다시 중지됩니다.
7. Hemocyte 농도는 hemocytometer에 의해 결정되며, 약 2,000 세포 chambered 유리 커버 풀렸는데에 추가하고, 실온에서 10 분에 대한 유리에 준수해야 사용할 수 있습니다. 이 밀도에서는 hemocytes은 유리 슬라이드 표면에 균일 monolayer를 형성합니다.
8. 호스트 hemocytes에 바인딩 세균 관찰, hemocytes 그러한 장염 fischeri ES114 및 / 또는 장염 harveyi B392, 녹색 형광 기자를 포함한 각으로 찬란 표시 박테리아 변종에 노출되어 있습니다. V. fischeri ES114 및 V. harveyi B392은 28에서 바다 물이 tryptone 미디어 (SWT)의 중간 단계 로그 ° 궤도 통에 C로 성장하고 있습니다. 600nm에서 광학 밀도는 셀 밀도를 결정하기 위해 spectrophotometrically 측정됩니다. 박테리아가 원심 분리 (5 분 5000 RPM)에 의해 pelleted 있으며, 표면에 뜨는이 무시되고 펠렛은 S - 링거스에 다시 일시 중지되었습니다.
9. 100,000 세균성 세포가 잘하므로 평균 hemocyte 50 세균이있다는 것을 각 챔버에 추가됩니다. hemocyte / 세균 혼합물은 25 S - 링어 S 솔루션 ° 1 H에 대한 C, 바인딩의 최대 수준을 항복하기로 결정 시간 incubated 수 있습니다.
10. hemocytes의 세포질은 다음 찬란 0.005 % CellTracker 오렌지 (Invitrogen)와 스테인드 후 세포를 시각화하는 S - 링거스에 씻어 수 있습니다.
11. 관련 박테리아 물들다 hemocytes는 자이스 혈구 디스커버리 V20 형광 입체경 또는 Leica SP2 스펙트럼 레이저 공촛점 현미경을 사용하여 형광 볼, 그리고 동물 세포의 전체 표면을 통해 열거됩니다.

대표 결과

두 족류 동물의 hemolymph가 산소에 세포 hemocyanin 아니라 헤모글로빈을 포함하고 있기 때문에, hemolymph은 진한 파란색을 설정합니다. hemolymph의 μl 당 ~ 5000 hemocytes의 평균이 방법을 사용하여 얻을 수 있습니다. chambered 커버 풀렸는데 형광 염색법을 준수 후 hemocytes는 모양 밝은 찬란 빨간색과 amoeboid 나타납니다. 세균 유착, V에 대한 fischeri 동안 V. (혈액 세포 당 1-2 세균 세포) hemocytes을 제대로 준수합니다 harveyi는 (hemocyte 당 10-15 세균 세포) 적극 준수합니다.

그림 1. 성인 하와이 밥테일 오징어 Euprymna은 두부 혈관의 위치를 보여주는 scolopes.

그림 2. 장염 fischeri (A)와 장염 harveyi (B)에 hemocyte 노출 결과. 레드 셀 커 오렌지, 그린, GFP - 라벨이 세균.

유익한 세균과 호스트 사이의 분자 신호를 중재에 면역 체계의 역할에 관한 연구, 최근에 그들의 microbiota와 eukaryotes의 공동 진화에 대한 우리의 이해에 중요한 기여를 만들었습니다. 오징어 / 비브리오 시스템은이 분야 ^2,3,5,6,8의 근본적 질문에 답변을 취급하기 쉬운 모델 시스템으로 자신을 증명되었습니다. 오징어 Euprymna scolopes의 가벼운 기관은 발광 박테리아 비브리오 fischeri들에 의해 독점적으로 식민지를 허용합니다. 조직 그 집에는 박테리아가 해수와 접촉에 남아 있기 때문에, 오징어는 특정 공생을 육성뿐만 아니라 다른 박테리아를 제외 계속해야합니다. 계속 연구는 대식 세포와 같은 hemocytes 가능성이 설립이 협회 ^1,4,7의 유지에 중요한 역할을하는 것으로 나타났습있다. 오징어 호스트는 적응 면역이 협회에서 발견되는 놀라운 특이성은 타고난 면역 시스템을 통해 전체 또는 부분적으로 중재되어야 부족하기 때문에. 이러한 혈액 세포의 최근 조사 hemocytes는 E.로부터 격리 것으로 나타났다 scolopes은 인식하고 phagocytose V. fischeri이 아닌 공생 박테리아 differentially 그 식민지는 가능성 symbionts ⁴ '면역 관용 "의 형식으로 연결됩니다. 이 프로토콜은 성공적으로 성인 오징어 이러한 혈액 세포를 얻고 박테리아를 바인딩하는 능력을 테스트하는 방법을 보여줍니다 것입니다.