Ottenere ematociti concentrati dal hawaiano Bobtail Squid Euprymna scolopes L'osservazione e la loro aderenza ai batteri simbionti e non Symbiotic

1. Preparare 500 ml di 0,22 micron, sterilizzata per filtrazione di acqua di mare artificiale (FSW; salinità 35 ppt). Filtro acqua di mare artificiale o naturale attraverso un micron 0,22 micron filtro per rimuovere le particelle e batteri.
2. Anestetizzare un adulto hawaiano bobtail calamari (Euprymna scolopes), mettendo in una soluzione al 2% di etanolo in FSW. Posto l'animale in anestesia per circa 10 minuti. Il calamaro cesserà di nuoto e non rispondere attivamente al tatto. Respirazione continua, indicato dal movimento del mantello, e l'attività chromatophore dovrebbe essere ancora osservato.
3. Luogo calamari con il lato ventrale rivolto verso l'alto su un vassoio standard dissezione cera. Immergere l'animale con FSW contenente 2% di etanolo.
4. Utilizzando uno standard da 200 puntali microlitri, tirare indietro l'imbuto e il mantello di esporre il vaso sanguigno principale cefalica si trova tra i due occhi.
5. Usando una siringa sterile 1 ml con ago calibro 26,5, forare il vaso sanguigno cefalica e ritirare tra 50-100 ml di emolinfa. Posizionare il emolinfa in un tubo sterile 1,5 ml su ghiaccio.
   Nota: Se un animale servirà come donatore più volte, solo prelevare 10-20 ml di emolinfa in un dato momento. Rispedire l'animale verso un serbatoio di acqua di mare normale. L'animale farà rivivere in 30 minuti.
6. Ematociti concentrati appena raccolte vengono lavate e risospese in 500 ml di soluzione Ringer Squid s (S-Inseparabili, 530 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM MgCl _2, 10 mM CaCl ₂ e 10 mM tampone HEPES, pH 7,5).
7. Le concentrazioni Hemocyte sono determinati da emocitometro, e circa 2.000 cellule sono aggiunti chambered scivola copertura in vetro, e ha permesso di aderire al vetro per 10 minuti a temperatura ambiente. A questa densità, il ematociti concentrati formano un monostrato uniforme sulla superficie del vetrino.
8. Per osservare batterica legame ematociti concentrati host, ematociti concentrati sono esposti ad un ceppo batterico fluorescente come il Vibrio fischeri ES114 e / o Vibrio harveyi B392, ognuno contenente un reporter verde fluorescente. V. fischeri ES114 e V. harveyi B392 sono cresciuto fino a metà-log in una fase di acqua di mare triptone media (SWT) a 28 ° C in un agitatore orbitale. La densità ottica a 600 nm viene misurata spettrofotometricamente a determinare la densità delle cellule. I batteri sono pellet per centrifugazione (5.000 rpm per 5 min), il supernatante viene scartato e il pellet è risospeso in S-Ringers.
9. 100.000 cellule batteriche vengono aggiunti a ciascuna camera bene in modo che ci sono 50 batteri per hemocyte in media. Il hemocyte / miscele di batteri vengono incubati in soluzione Ringer S-s a 25 ° C per 1 h, un tempo determinato per produrre il massimo livello di legame.
10. Citoplasma della ematociti concentrati vengono poi colorate con CellTracker fluorescente arancione 0,005% (Invitrogen) e poi lavati in S-Ringers per visualizzare le cellule.
11. Ematociti concentrati colorati con i batteri associati sono visualizzati da fluorescenza utilizzando un Zeiss Discovery stereoscopio fluorescenti V20 SP2 o un microscopio laser confocale Leica spettrale, ed enumerate su tutta la superficie della cellula animale.

Rappresentante Risultati

Perché emolinfa cefalopodi contiene hemocyanin extracellulare e non emoglobina, dopo l'ossigenazione, la emolinfa diventa blu scuro. Una media di ~ 5000 ematociti concentrati per l di emolinfa si ottiene con questo metodo. Dopo l'adesione al scivola coprire i camerati e colorazione fluorescente, il ematociti concentrati dovrebbe apparire luminoso fluorescente rosso e ameboidi in forma. Per adesione batterica, V. fischeri aderisce male al ematociti concentrati (1-2 cellule batteriche per cellula del sangue), mentre V. harveyi aderisce fortemente (10-15 cellule batteriche per hemocyte).

Figura 1. Adulto Hawaiano bobtail calamari Euprymna scolopes mostra la posizione dei vasi sanguigni cefalica.

Figura 2. Risultati di esposizione hemocyte di Vibrio fischeri (A) e Vibrio harveyi (B). Rosso, Cell Tracker Arancione, verde, GFP-etichettata batteri.

Studi riguardanti il ​​ruolo del sistema immunitario nella mediazione di segnale molecolare tra batteri benefici ei loro ospiti hanno, negli ultimi anni, dato un contributo significativo alla nostra comprensione della co-evoluzione degli eucarioti, con la loro flora batterica. Il calamaro / vibrione del sistema si è dimostrato come sistema modello trattabile per rispondere alle domande fondamentali in questo campo ^2,3,5,6,8. La luce-organo del Euprymna calamari scolopes permette di colonizzazione esclusivamente dalla luminosa batterio Vibrio fischeri. Perché i tessuti che ospitano il batterio rimane in contatto con acqua di mare, i calamari non devono solo promuovere la simbiosi specifici, ma anche continuare a escludere altri batteri. Continua gli studi hanno dimostrato che macrofagi come ematociti concentrati probabilmente svolgono un ruolo importante nella creazione e mantenimento di questa associazione ^1,4,7. Perché l'host calamari manca l'immunità adattativa, la specificità stupefacente trovato in questa associazione deve essere intero o parzialmente mediata attraverso il sistema immunitario innato. Una recente indagine di queste cellule del sangue hanno rivelato che ematociti concentrati isolato da E. scolopes riconoscere e fagocitare V. fischeri e non batteri simbiotici differenziata e che la colonizzazione porta probabilmente ad un tipo di "tolleranza immunitaria" dei simbionti ^4. Questo protocollo dimostrerà come ottenere con successo queste cellule del sangue da calamari adulti e prova la loro capacità di legare i batteri.