Skaffa hemocyter från Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes Och observera att de följer Symbiotiska och icke-symbiotiska bakterier

1. Förbered 500 ml av 0,22 ìm filter-steriliserade konstgjort havsvatten (FSW, salthalt 35 ppt). Filtrera genom naturligt urval eller havsvatten genom ett 0,22 ìm mikron filter för att avlägsna partiklar och bakterier.
2. Bedöva en vuxen Hawaiian bobtail bläckfisk (Euprymna scolopes) genom att placera i en 2% lösning av etanol i FSW. Placera djuret i narkos i ca 10 minuter. Bläckfisk upphör simning och kommer inte att aktivt svara på beröring. Fortsatt andning, indikeras av rörelse manteln, och chromatophore verksamhet bör ändå följas.
3. Placera bläckfisk med ventrala sidan uppåt på en vanlig vax dissektion facket. Sänk ner djuret med FSW innehållande 2% etanol.
4. Använda en standard 200 l pipettspetsar, dra tillbaka tratten och mantel att exponera de viktigaste cefaliska blodkärl ligger mellan två ögon.
5. Med en steril 1 ml spruta med 26,5-gauge kanyl, punktera den cefaliska blodkärl och tillbaka mellan 50-100 ìl hemolymph. Placera hemolymph i ett sterilt 1,5 ml rör på is.
   Obs: Om ett djur kommer att fungera som givare flera gånger, bara dra 10-20 ìl hemolymph vid varje given tidpunkt. Tillbaka djuret till ett normalt havsvatten tank. Djuret kommer att återuppliva inom 30 min.
6. Nytagen hemocyter tvättas och resuspenderas i 500 l av Squid Ringer s lösning (S-Ringers, 530 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mm MgCl _2, 10 mm CaCl ₂ och 10 mm HEPES buffert, pH 7,5).
7. Hemocyte koncentrationerna bestäms av hemocytometer, och cirka 2000 celler läggs till chambered glas täckglas, och får följa glaset i 10 min i rumstemperatur. Vid denna täthet, hemocyter bildar ett enhetligt monolager på glasplatta ytan.
8. För att observera bakterier binder till värd hemocyter är hemocyter utsätts för en fluorescerande bakteriestam som Vibrio fischeri ES114 och / eller Vibrio harveyi B392, som båda innehåller ett grönt fluorescerande reporter. V. fischeri ES114 och V. harveyi B392 odlas till mitten logga fas i ett havsvatten trypton media (SWT) vid 28 ° C i en skakapparat. Den optiska densiteten vid 600 Nm mäts spektrofotometriskt att bestämma celltätheten. Bakterierna är pelleterat genom centrifugering (5000 rpm i 5 min) är supernatanten bort och pelleten är resuspenderas i S-ringsignaler.
9. 100 tusen bakterieceller läggs till varje kammare väl så att det finns 50 bakterier per hemocyte i genomsnitt. Den hemocyte / bakterier blandningar inkuberas i S-Ringer s lösning vid 25 ° C under 1 timme, en gång bestämt sig för att ge den högsta bindande.
10. Cytoplasman av hemocyter sedan fluorescerande färgas med 0,005% CellTracker Orange (Invitrogen) och sedan tvättas i S-Ringers för att visualisera celler.
11. Målat hemocyter med tillhörande bakterier ses av fluorescens med hjälp av antingen en Zeiss Discovery V20 fluorescerande stereoskopet eller en Leica SP2 spektral laser konfokalmikroskop och uppräknade över hela ytan av djuret cellen.

Representativa resultat

Eftersom bläckfisk hemolymph innehåller extracellulära hemocyanin och inte hemoglobin, på syresättning kommer hemolymph tur mörkblå. I genomsnitt ~ 5000 hemocyter per mikroliter av hemolymph kommer att erhållas med denna metod. Efter anslutning till chambered täckglas och fluorescerande färgning bör hemocyter visas klart fluorescerande röda och amöboid i form. För bakteriell vidhäftning, V. fischeri fäster dåligt på hemocyter (1-2 bakteriella celler per blodkroppar) medan V. harveyi fäster starkt (10-15 bakterieceller per hemocyte).

Figur 1. Vuxen Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes visar position cefaliska blodkärl.

Figur 2. Resultat av hemocyte exponering för Vibrio fischeri (A) och Vibrio harveyi (B). Röd, Cell Tracker orange, grönt, GFP-märkta bakterier.

Undersökningar roll i immunsystemet att medla molekylär signalering mellan nyttiga bakterier och deras värdar har under de senaste åren gjort betydande bidrag till vår förståelse av samevolution av eukaryoter med mikrober. Den squid / Vibrio-systemet har visat sig vara en lätthanterlig modell för att besvara grundläggande frågor inom detta område ^2,3,5,6,8. Ljuset-organ i bläckfisk Euprymna scolopes tillåter kolonisering uteslutande av självlysande bakterien Vibrio fischeri. Eftersom vävnader som huset bakterierna kommer i kontakt med havsvatten skall ha bläckfisken inte bara gynna de specifika symbios, men också att fortsätta att utesluta andra bakterier. Fortsatta studier har visat att makrofager-liknande hemocyter sannolikt spelar en viktig roll i upprättandet och underhållet av denna förening ^1,4,7. Eftersom bläckfisk värd saknar adaptiv immunitet, den fantastiska specificitet finns i denna förening ska helt eller delvis förmedlad genom det medfödda immunförsvaret. En färsk undersökning av dessa blodkroppar visade att hemocyter isolerade från E. scolopes känna igen och phagocytose V. fischeri och icke symbiotiska bakterier differentiellt och att kolonisationen leder sannolikt till en typ av "immuntolerans" av symbionter ^4. Detta protokoll kommer att visa hur man framgångsrikt kan få dessa blodkroppar från vuxna bläckfisk och testa deras förmåga att binda bakterier.