A reversível, método não-invasivo para medições de Resistência das Vias Aéreas e Amostragem Líquido da Lavagem Broncoalveolar em Ratos

Alérgeno desafio:

1. Camundongos C57BL / 6, 4-8 semanas de idade, são anestesiados em uma câmara hermética plexiglass purgado com isoflurano 3,2% em mistura de vapor de oxigênio por 10 minutos para atingir a anestesia geral profunda.
2. Desafios alérgeno intranasal (OVA 45μL (22,5 g) e 7μL A. oryzae (7 mg), em PBS) são administrados, todas as terças, quintas e domingos, para um total de sete aplicações consecutivas.

Anestesia:

3. Antes de cada desafio alérgeno, e após o desafio 7, ratos são administradas uma injeção intraperitoneal de 48 mg / kg etomidato (2 mg / ml), antes da colocação em um recipiente de luz excludente.
4. Assunto permanece no recipiente até que a falta de resposta neurológica observável é detectado mediante aplicação de pressão para as patas traseiras (5-10 min).

Intubação:

5. A lâmpada de calor radiante, mantidos a uma distância para garantir a manutenção de ~ 37 ° C da temperatura corporal central, deve ser centrado sobre o assunto durante todo o procedimento para evitar a hipotermia. Um termômetro retal deve ser usado pelo menos inicialmente para confirmar euthermia independentemente da fonte de calor utilizada.
   
   PASSOS CRÍTICA Todos os fluidos e instrumentos recebidos por animais experimentais deve ser estéril; procedimentos devem ser realizados sob condições estritas de assepsia. Hipotermia prolongada, enquanto sob anestesia vai levar a dados aberrantes e / ou morte dos animais. Competência com todos os procedimentos invasivos devem ser desenvolvidos com animais de cadáver antes de tentar trabalhar com animais vivos. Lubrificante oftálmica deve ser usado para evitar abrasões da córnea de animais sob anestesia geral.
6. Ratos anestesiados são removidos do recipiente e colocado na posição reclinada (acima do lado ventral), na tabela pletismógrafo, ajustado para um ângulo de 45 °.
7. A faixa de borracha envolvendo a tabela é inserida por trás da fileira de cima dos incisivos para assegurar o assunto no lugar. Com uma pinça na mão direita, pega, estender e levantar a língua da boca antes de fixar no lugar com um metal depressor na mão esquerda; permitindo assim uma via aérea desimpedida para a intubação.
8. Um fio de fibra ótica 0,8 milímetros de diâmetro, conectado a uma fonte de luz, é inserido através da angiocateter e estendida 10 mm em relação a ponta. Como o depressor é firmado com a mão esquerda, o fim iluminado do fio de fibra ótica é guiado através da cavidade oral e faringe pela direita, até que as cordas vocais são visualizadas. O fio é então passado sob visão direta através das cordas vocais e se movendo na traquéia, programada para ocorrer quando os cabos estão maximamente aberto.
9. O angiocateter é então passado sobre o fio de fibra óptica para dentro da traquéia até a ponta do cateter está dentro da porção média da traquéia. 17-22 para ratos grama, o que corresponde a um segmento de cateter 10 milímetros continue a ser visível entre o conector eo extremo cranial da mandíbula o assunto s. A quantidade real pelo qual o cateter é passado deve ser determinada por inspeção direta da traquéia de 2-3 camundongos cateterizada do tamanho relevante e de fundo genético.
10. O fio de fibra ótica é removido e intubação sucesso é confirmado pela observação regulares respirações profundas (excursões rítmica do tórax e abdômen), que rescindir imediatamente após a oclusão do conector com o polegar. Uma resposta asfixia, independentemente do polegar-oclusão, respiração irregular, ou outros sinais de dificuldade respiratória são indicativos de mau posicionamento angiocateter e geralmente indicam intubação esofágica.
    
    Não passo crítico para rapidamente inverter uma intubação esofágica pode ser letal. Se houver suspeita de intubação esofágica, o cateter deve ser rapidamente removido e reinstalado uma vez que o animal tenha retomado um padrão de respiração normal. Etomidato é o anestésico de escolha, de todos os anestésicos roedores disponíveis, este agente provoca o menor toxicidade cardiovascular (hipotensão, arritmia, parada cardíaca).
11. Tabela inferior pletismógrafo até paralelo com a bancada de trabalho e transformá ° Sujeito de 180 até enfrentar o ar porta ventilador. Vire animais em seu lado antes de conectar ao ventilador.
12. A intubação sucesso é confirmado quando, depois de assegurar uma ligação estanque e ativando o ventilador (funcionamento a 150 respirações / minuto, 9 ml / g de marés, oxigênio a 100%), excursão tóraco-abdominal é visto a andar com o ventilador.

Linha intravenosa:

13. A 10 mm, agulha de 27ga é removido de sua seringa conector por meio de derretê-lo livre, e dobrar a agulha de 90 ° no ponto médio usando uma pinça estéril e hemostat de modo que o bisel enfrenta no ângulo. O fim não-chanfrado está conectado à tubulação PI10 levando à porta de injeção IV.
14. Para evitar que potencialmenteembolização de ar fatal, a tubulação e agulha são removidas com 37 ° C, 0,9% NaCl através da seringa de 1 ml. A porta de injeção consiste de uma agulha 27ga, empurrado por meio de um furo na tampa de um tubo de centrífuga de 15ml. A tampa é preenchido com solução salina, tais que a ponta da agulha está constantemente submerso, reduzindo assim a probabilidade de que o ar será arrastado na agulha e injetada por via intravenosa.
15. Com o mouse restantes sob a lâmpada de calor, a agulha está alinhada no extremo caudal do paralelo cauda e sobre a veia lateral. A agulha é correr um pouco abaixo da pele, enquanto dirigido cranialmente ao longo do comprimento da veia s e empurrado por via subcutânea a curva. IV colocação bem sucedida é confirmada pela observação de refluxo de sangue no tubo IV com ligeira de puxar o êmbolo da seringa. Além disso, deve haver livre fluxo através da linha IV após a injecção de 50-100 mL solução salina na veia da cauda. Veias da cauda ocasionais não podem ser estavelmente canulados. Nesses casos, o mouse pode ser girado 180 graus para o outro lado ea cauda outros IV normalmente acessados ​​sem dificuldade.
16. Depois de retirar a lâmpada de calor a partir da configuração, o assunto está incluído no pletismógrafo, posteriormente garantido como hermética com a aplicação de 4 grampos.
    
    Permitir que a etapa crítica lâmpada de calor para permanecer na vontade de aquecer o ar na câmara de pletismógrafo e potencialmente alterar as medidas subsequentes de R Sterility _RS de agulhas iv e soluções deve ser mantida. Esterilização de agulhas é realizado por imersão e lavagem com etanol 70% seguido de lavagem e lavagem com solução salina estéril antes iv inserção. Além disso, a cauda deve ser limpa com álcool 70% ou álcool isopropílico antes da inserção iv.

Resistência das vias aéreas medidas:

17. Resistência de pico é determinado pela quantificação contínua do quociente DPT / V (onde DPT é a mudança na pressão traqueal e V é o fluxo de ar) nos pontos de volume pulmonar igual (70% do volume corrente). DPT é determinada usando um transdutor de pressão conectado ao angiocateter traqueal. Para determinar V, variações de pressão pletismógrafo são calibrados para mudanças de volume ao longo dos níveis fisiológicos estudados. O diferencial do volume pletismógrafo ao longo do tempo, calculado pelo módulo de pré-amplificador, é V. Depois de estabelecer uma linha de base estável R _RS (<5% de variação superior a 3 minutos), cinco doses sucessivas (volume = 2 peso corporal mL / g) de aumentar concentrações de cloreto de acetilcolina (0,058, 0,18, 0,59, 1,58 e 5,8 mg / kg de peso corporal, em solução salina 0,9%, pH 7,4, mantido em gelo e mão-aquecido antes de cada injeção) são injetados mais de um segundo através do iv, com cada dose subseqüente administrada após o retorno de R _RS à linha de base, até o triplo da resistência de base (cerca de 12 cm H ₂ O x ^-1 x ml seg, ou seja, um aumento de 200% na resistência das vias aéreas acima da linha de base típica de aproximadamente 4 cm H ₂ O x ml ^-1 x sec) é alcançado. A concentração provocativa de Ach, em mg / g de peso corporal, que provoca um aumento de 200% em R _RS desde os valores iniciais (denominado PC _200), é calculado por interpolação matemática do Ach-R _RS curvas dose-resposta.
18. Uma vez que PC ₂₀₀ valores foram alcançados, fixadores de lançamento, e desmontar o pletismógrafo. Um máximo de cinco doses crescentes de Ach é dado. A faixa de concentração Ach dado acima é adequado para alcançar PC ₂₀₀ valores de linhagens de camundongos mais ingênuo.
    
    Passo crítico Quando uma base de aproximadamente 4 cm H ₂ O x ml ^-1 x sec é elaborado a monitorar a resistência por 30 segundos, a 60 mL de solução salina pode ser injetado iv para confirmar que o plano adequado de anestesia foi alcançado. Com anestesia completa, não haverá nenhuma mudança significativa na resistência; um aumento na resistência ou movimento dos membros ou cauda representa um sinal de sofrimento físico e indica a necessidade de anestésico adicional.
19. Remover IV da veia da cauda e depois desligue o animal do ventilador, manutenção da função respiratória, mantendo a cânula traqueal no local. Animais ocasionais não para retomar a respiração espontânea imediatamente. Nestes casos, a respiração pode ser estimulada por massageando suavemente o tórax.
    
    Respiração espontânea passo crítico deve ser estabelecido antes da transferência para a câmara de recuperação, caso contrário mortes irão ocorrer.
20. Após a retomada da respiração espontânea, os camundongos são transferidos com cânulas traqueais no lugar, para uma câmara purgada com 100% de O ₂ e manutenção a 37 ° C usando uma lâmpada de calor. Dentro de 15-20 minutos, os ratos estão respirando forte e começando a se mover suas extremidades, altura em que o cateter traqueal pode ser removido e animais safely transferidos para suas gaiolas regular.
    
    ETAPA CRÍTICA A via aérea obstruída é facilmente no mouse inconsciente devido à hiper-salivação induzida pela acetilcolina e é a principal razão para a morte asfixia relacionados em ratos anestesiados seguintes medições fisiológicas das vias aéreas. Por esta razão, a cânula traqueal deve permanecer no lugar, mesmo em camundongos não submetidos a lavado broncoalveolar, até que sejam desperta e não deve ser removida até hiper-salivaton cessou.

Lavado broncoalveolar:

21. Coleta de lavado broncoalveolar é seguro quando os ratos recuperar suficientemente suas gag reflex (~ 20 minutos após a colocação em câmara de recuperação). O reflexo da mordaça é avaliado, deslizando suavemente a angiocateter interior e exterior, tosse ou dificuldades óbvias indicam que o reflexo da mordaça está de volta.
    
    Etapa crítica Permitindo também um tempo de recuperação prolongado irá diminuir consideravelmente a eficiência de retorno do LBA de ratos individual; assim, o reflexo de vômito deve ser monitorada a cada poucos minutos, após o período de 20 min sugeriu descansando. Se os ratos são incapazes de tolerar o procedimento de lavagem, devido ao despertar parcial, 3,2% anestesia isoflurano vapor pode ser usado.
22. Um fio-guia metálico intubação (0,5 mm OD), com uma curva contínua de ~ 30 ° direcionado para o lobo esquerdo do pulmão, é inserido no angiocateter. O fio-guia e angiocateter são avançados em conjunto para o lobo esquerdo do pulmão, de modo que o cateter (hub excluídos) se estende para além dos dentes da frente por um milímetro só.
    
    Não passo crítico para isolar pulmão esquerdo irá reduzir significativamente o rendimento, enquanto aumentando a probabilidade de morte do animal. Cuidados devem ser tomados para garantir que a ponta do fio-guia não passa através da extremidade aberta do angiocateter. Avanço da angiocathether com a ponta metálica saliente pode levar uma laceração traqueal e morte devido à ruptura de traquéia.
23. Mantendo o angiocateter no lugar, o fio-guia é retirado e 300 mL de PBS (pH 7,4, estéril) é lavada para o pulmão esquerdo através de uma seringa de 1 ml. Imediatamente após, enquanto que a elaboração do êmbolo da seringa para criar pressão negativa, o angiocateter está lentamente (3 s) removido enquanto intensamente massageando o pulmão. Um retorno de 100-200 mL BAL é esperado.
24. Devolver imediatamente os ratos lavaged aos 37 ° C, 100% O ₂ câmaras, enquanto continuamente massagear o tórax. Camundongos lugar em seu lado esquerdo até que totalmente recuperado (~ 20 min). Os animais são então colocados de volta em suas gaiolas.

CALENDÁRIO:

Por mouse, todo o procedimento deve demorar mais de uma hora para realizar: Passo min, 3-4 10/05, 21/05 Passos, 10 min; Etapa 22, 20-30 min; Passos 23-24,... 10 min. Com proficiência aumentou e por temas surpreendentes no protocolo, até 3 ratos / hora pode ser processado.

Resultados representativos:

Hiper-reatividade das vias aéreas em ratos, como determinado por medidas de PC ₂₀₀ valores, é uma conseqüência da ativação e recrutamento para os pulmões das células T ea secreção da citocina IL-135-7. Assim, a hiper-reatividade das vias aéreas não é a conseqüência inevitável de desafio das vias aéreas com alérgeno, mas depende de um compartimento de células T imunes intacta eo tempo necessário para respostas de células T para desenvolver no ambiente da exposição alergênica repetido. Como mostrado na figura. 2a, hiper-reatividade das vias aéreas, definida como PC ₂₀₀ valores que são significativamente mais baixos em comparação aos valores basais, desenvolvido depois de 5 desafios alérgeno sem aumento significativo após o desafio sexta. Por razões que não são completamente compreendidos, reatividade das vias aéreas diminuiu (PC ₂₀₀ valores aumentados), após a provocação alergênica primeiro (Fig. 2a). Tendências similares são aparentes, comparando as curvas de resposta Ach dose para os ratos mesmo (Fig. 2b). No entanto, é aparente hiper-reatividade das vias aéreas aqui que completa desenvolve abruptamente após a provocação alergênica quinto, de tal forma que os ratos tornam-se mais de 30 vezes mais sensível à Ach entre os desafios quarto e sexto. Juntos, esses resultados indicam que as medidas mais confiáveis ​​de AHR são obtidos após seis desafios alérgeno (12 dias); medidas em intervalo de tempo anterior são susceptíveis de produzir dados altamente variável. Repetidamente ratos desafiados com veículo por via intranasal (solução salina) não desenvolvem hiper-reatividade das vias aéreas, e, em todas as doses de Ach dado, medições R _RS não variar significativamente desde os valores iniciais (Fig. 3 e dados não mostrados).

Antes do surgimento da AHR robusto, o tipo de célula dominante das vias aéreas induzida por alérgenos foi o de neutrófilos (Fig. 4). Semelhante à tendência para a AHR, no entanto, eosinofilia gradualmente reforçada com o desafio alérgeno repetidas e os eosinófilos tornou-se o tipo de célula numericamente dominante no BAL fluido after o sexto desafio, coincidente com um declínio acentuado no número de neutrophis (Fig. 4). Macrófagos inicialmente aumentaram em número com a primeira desafios alérgeno poucos e flutuou em abundância depois. Abundância de linfócitos não se alterou significativamente, independentemente do número de desafios alérgeno e, paradoxalmente, dada a sua importância primária para o modelo, normalmente são a célula menos numerosos no LBA.

Medições de resistência das vias aéreas em camundongos que receberam nem a provocação alergênica nem amostragem BAL não variou ao longo dos 17 dias de experimentação. De amostragem de fluido repetido BAL na ausência de medições das vias aéreas fisiologia ou provocação alergênica também foram realizadas, e mostrou apenas um reforço de neutrófilos e recrutamento de macrófagos para as vias aéreas que não persistem depois dos 5 dias (dados não mostrados). Estes resultados demonstram que a neutrofilia proeminentes observados em camundongos desafiados alérgeno é em grande parte o resultado do procedimento e não ao antígeno.

No controle, PBS-desafiou os ratos, as medições de resistência das vias aéreas também não variou significativamente ao longo do tempo. Aprimorada de macrófagos e neutrófilos, mas não de recrutamento, de eosinófilos para LBA também foi visto nesses camundongos, semelhantes às alterações observadas em camundongos que receberam apenas a amostragem de fluido repetido BAL (Fig. 4 b, d). Juntos, esses dados reforçam a importância de o alérgeno, e não a manipulações diferentes das vias aéreas, à indução de ambos inflamação das vias aéreas alérgicas (eosinofílica) e AHR.

Resultados semelhantes podem ser esperados com alérgenos intranasal análoga à proteinase que usamos aqui. No entanto, muitos pesquisadores usam ovalbumina para induzir doença pulmonar alérgica. Depois de um período adequado de priming intradérmica ou intraperitoneal (1-2 semanas) com ovalbumina precipitados em um sal de alumínio, um fenótipo de asma robusto, incluindo hiper-reatividade das vias aéreas, pode ser esperado dentro de 24 horas depois de um desafio único intranasal com ovalbumina solúvel.

Figura 1. Representação fotográfica de um pletismógrafo roedor, imediatamente antes da gravação das vias aéreas de medição fisiologia.

Figura 2. Medições de resistência das vias aéreas. A) Para fins estatísticos, antilog PC ₂₀₀ valores são relatados. Observe o grande aumento no PC antilog ₂₀₀ após primeiro desafio e conseqüente diminuição seguir novos desafios. B) resistência do sistema respiratório (RRS): Observe a inclinação da Ach-RRS curvas dose-resposta após desafios sexto e sétimo. Barras de erro representam SEM.

Figura 3. Representante em tempo real resistência do sistema respiratório (R _RS) traçados a partir de um alérgeno naïve (A) e 6X desafiou mouse (B) a receber doses consecutivas IV da Ach. Valores de dose são apresentados em mg / kg de unidades.

Figura 4. Diferencial contagem de células imunológicas nas amostras de lavado broncoalveolar derivado do pulmão esquerdo de ratos tratados com sete consecutivos desafios intranasal. Abundância de porcentagem (%) de células imunes em ratos tratados com alérgeno (A) ou PBS (B). Número total de células do sistema imunológico de ratos tratados com alérgeno (C) ou PBS (D). Valores representados como média + / - sem.

O estudo da asma, e várias outras doenças obstrutivas das vias aéreas, constitui um campo ativo e expansão da pesquisa biomédica. Um componente importante da pesquisa relacionados à asma experimental é a capacidade de medir mudanças no tamanho das vias aéreas, sob condições variáveis. Estreitamento das vias aéreas excessivo em resposta ao desafio provocador, uma característica canônica de asma e doenças pulmonares relacionadas e uma propriedade da hiperreactividade das vias aéreas denominado, é um componente importante de ataques clinicamente significativo levando a falta de ar e outros sintomas, incluindo a morte.

Neste estudo, um novo método foi desenvolvido para medir a hiperreactividade das vias aéreas e, simultaneamente, amostras de células inflamatórias recrutadas para as vias aéreas em ratos. Nós mostramos que hiperresponsividade das vias aéreas não é imediatamente induzido com o primeiro, ou mesmo passados ​​os primeiros, de sete alérgeno consecutivos desafios dado mais de 15 dias. Em vez disso, hiperresponsividade das vias aéreas aumenta apenas gradualmente com o desafio alérgeno progressiva, tornando-se altamente significativo (em relação aos animais sham alérgeno desafiado) somente após 6 desafios (12 dias). Esta alteração acentuada das vias aéreas fisiologia aproximadamente paralelo com o influxo de células inflamatórias pulmonares, marcou mais proeminente por eosinófilos, que aparecem pela primeira vez no fluido das vias aéreas lavagem em grande número (> 10 ⁶ / ml) após a provocação alergênica 5.

Estes achados são consistentes com a demonstração prévia de que as células T helper tipo 2 (Th2) mediar tanto hiperresponsividade das vias aéreas e eosinophilia6, mas estender essas observações, demonstrando o tempo mínimo (12 dias) necessário para estes parâmetros para se tornar máxima com semi-contínua exposição ao alérgeno . Os graus de hiper-reatividade das vias aéreas máxima e eosinofilia das vias aéreas aqui relatados são provavelmente o máximo possível com o mouse usando este alérgeno como desafio alérgeno ainda não conseguiu obter respostas maior (dados não mostrados).

Mais importante ainda, estes dados demonstram que a hiper-reatividade das vias aéreas medições e análise de células inflamatória das vias aéreas podem ser rigorosamente realizados repetidamente no mesmo grupo de camundongos. Além de dar continuidade aos dados recolhidos em série, os protocolos descritos permitem a redução dos custos experimental (ratos menos exigido para cada estudo) e poder estatístico avançado (medidas repetidas dos mesmos animais, em oposição aos dados de grupos distintos). A forte base teórica subjacente o método descrito fisiológicas ^8, acrescentando ainda confiança para os dados coletados. Com esforço dedicado, proficiência com as técnicas descritas é facilmente obtida, fornecendo uma ferramenta extremamente importante conjunto para investigar doença pulmonar experimental alérgica e outras doenças pulmonares.