Enregistrements Sensillum simple chez les insectes Drosophila melanogaster Et Anopheles gambiae

Maurizio Pellegrino, Takao Nakagawa, Leslie B. Vosshall

Laboratory of Neurogenetics and Behavior, Rockefeller University

1. Odeur dilutions

1. La plupart des substances odorantes sont solubles dans l'huile de paraffine. Cependant, le DMSO ou l'éthanol peut aussi être utilisé comme solvant de remplacement pour les odeurs particulières. Préparer des dilutions appropriées (par exemple, volume 01h10: volume, v: v) de substances odorantes pures dans des flacons en verre. La plupart des dilutions d'odeurs sont stables à température ambiante, mais pour des composés très volatils, il est préférable de faire des dilutions de travail sur une base hebdomadaire. Chaque sensillum répond aux odeurs différentes au sein d'une gamme de concentration différents. Pour la drosophile, une utile look-up table pour des concentrations appropriées pour une utilisation avec un sensillum donné peut être trouvé dans ^{6, 7.}
   
   Pour l'expérience de la vidéo, nous utilisons l'huile de paraffine comme un contrôle de solvants et d'acétate de méthyle (10 ^-6 v: v dans l'huile de paraffine) et 1-octène-3-ol (10 ^-7 v: v dans de l'huile de paraffine) pour la drosophile et l'anophèle enregistrements, respectivement.
2. Avec des ciseaux, couper le papier chromatographie en 3 mm x 5 cm afin que les bandes elles s'adapter à l'intérieur des pipettes Pasteur.
3. Pipeter 30 uL de l'odeur désirée sur une bande de papier filtre et l'insérer dans la pipette en verre. Couper ~ 3 cm de tube conduite d'air et de l'insérer dans l'extrémité ouverte de la pipette, il clôture avec un connecteur. Le connecteur est utilisé pour sceller la pipette qui sera ensuite fixé à la tubulure d'air en ligne d'une pompe à air quand il est temps de livrer les odeurs lors de l'expérience.

2. Système de livraison d'odeur

1. L'utilisation d'un petit foret, couper un 10 ml en plastique pipette sérologique (par exemple à la marque de 4 ml) et de créer deux trous (par exemple à l'mL -1,5 et -0,5 marques ml) qui sera utilisé pour contenir des pipettes contenant les odeurs. Insérez une pointe de pipette 200 uL dans le coupleur de barbelés et d'introduire le coupleur dans l'extrémité émoussée de la pipette 10 ml. La pipette sera utilisé dans le cadre du système de livraison pour odorants.
2. Fixer la pipette sur un support magnétique avec une pince pipette et le positionner à proximité du microscope.

3. Électrodes à aiguiser

1. Pour affûter les électrodes, préparer une solution 0,5 M d'hydroxyde de potassium (KOH) et on filtre pour éliminer les particules fines (par exemple en utilisant un filtre 45 pm). Prendre une seringue de 20 ml et faire un petit trou (diamètre ~ 2 mm) en utilisant une aiguille sur le mur près de la pointe (~ 1 cm de la pointe), dans lequel le fil électrique est inséré (figure 1A).
2. Remplir la seringue avec 0,5 M de KOH, et il pince sur un stand sous le microscope de telle sorte que l'extrémité est placée dans le champ de vision (figure 1B, C). Insérez le fil électrique dans le petit trou sur le mur seringue (figure 1B), en s'assurant que le fil n'est pas directement en face de l'entrée de la seringue. Connectez ce fil à la cathode d'une alimentation DC (par exemple, Wild Heerbrugg MTR32, voir méthodes) ou d'un pôle d'une alimentation en courant alternatif (par exemple, Wild Heerbrugg-LEP 990 018). Fixez l'arbre porte-électrode sur le micromanipulateur manuel sur le côté droit du microscope, et attacher un câble électrique à la base de l'arbre porte-électrode avec une pince crocodile. Branchez le câble à l'anode de l'alimentation DC ou l'autre pôle de l'alimentation CA (figure 1A).
3. Insérez le fil de tungstène (longueur ~ 5 cm) dans le porte-électrode, et l'attacher à l'arbre porte-électrode sur le manipulateur. Régler l'alimentation de 6 V, et d'insérer la pointe du fil dans la seringue à plusieurs reprises pour qu'il parfaire, en prenant soin de suivre la pointe sous le microscope pendant le processus (figure 1C). Pour obtenir une électrode idéale pour l'enregistrement, placer 90% de sa longueur dans la solution pendant 1 min, et tirez-le lentement. Ensuite, insérez seulement ~ 50% de l'électrode d'autres fins pendant 30 s, et de le répéter pour obtenir le bout du fil aiguisé (~ 10 fois).
   
   La pointe de l'électrode doit être assez fine pour entrer dans le sensillum, mais pas si belle que de se plier quand il le touche pendant les enregistrements (les étapes 6 et 7). Bien regarder la pointe de l'électrode sous la loupe binoculaire pendant qu'elle est aiguisée est une bonne indication de son épaisseur, seulement le regarder sous le microscope à fort grossissement d'enregistrement vous donnera une idée claire si une électrode donnée est adapté pour l'enregistrement.

4. Insecte de préparation: Drosophila antenne

1. Construire un aspirateur voler. Coupez un morceau de tube en ligne d'air suffisamment longtemps pour pendre confortablement autour de votre cou (environ 90 - 120 cm). Couper l'extrémité d'une pointe de pipette 200 ul et l'insérer dans l'une des extrémités du tube. Sur la fin, une autre position ~ 1,5 cm x 1,5 cm morceau de grillage afin qu'il crée une barrière physique, mais n'empêche pas l'air de s'écouler hors du tube. Couper l'extrémité d'une pointe de 1 pipette mL et la position de l'extrémité la plus large sur le dessus de l'ouverture du tube, en bloquant le maillage entre les deux. Cette partie sera utilisé pour ramasser et de manipuler des mouches du vinaigre pour adultes (figure 2).
2. Prenez une lame de microscope et placer un morceau de cire dentaire à peu près au milieu du côté long. En plus de cela Positiona couvercle en verre légèrement incliné vers le haut (~ 30), en s'assurant que la cire n'est pas directement sous la partie supérieure, ce qui empêcherait la visualisation de la mouche du vinaigre sous le microscope. Tirez une électrode de verre avec l'extracteur vertical. Sa pointe doit être mince et assez souple pour s'adapter entre les deuxième et troisième segments antennaires, et maintenir la stabilité de l'antenne pour les enregistrements. Position de l'électrode de verre sur un autre morceau de cire et placez-le sur le côté du couvercle en verre, assez loin pour que lorsque la pointe est abaissé ce qu'il atteigne l'angle de la lamelle (figure 3A).
3. Travaillant à partir d'une bouteille ou un flacon de mouches adultes du génotype désiré, ramasser une mouche du vinaigre pour adultes en utilisant l'aspirateur voler. Bien que les femelles sont généralement utilisées en raison de leur plus grande taille, les mâles peuvent également être utilisés. Placez une extrémité 200 uL pipette sur le dessus de la pointe 1 ml pour éviter la volée de s'échapper. Soufflez dans le tube, de sorte que la mouche est poussé vers l'extrémité de la pointe de pipette 200 ul. Coupez le bout le plus large de l'extrémité de la pipette avec la lame de rasoir à quelques millimètres de la mouche elle-même, puis insérez un peu de cire pour empêcher l'avion de reculer. Sous un microscope, couper à nouveau près de la tête de la mouche du vinaigre, en accordant une attention à ne pas endommager l'animal. Avec une petite pointe de la pipette, pousser la cire à la tête de volée vigueur de telle sorte que la moitié environ des yeux extrusion de la pointe (figure 3B). Assurez-vous que ses jambes ne sortent pas aussi bien, ou ils pourraient se déplacer et d'interférer avec les enregistrements.
4. Montez la volée sur un morceau de cire, sa tête tournée vers le haut, et le placer sur la diapositive à l'avant du verre de couverture. Poussez la tête légèrement contre le coin de la vitre, de sorte que les antennes d'étendre et de repos sur le verre. Abaissez le bout du capillaire de verre dans le segment entre les deuxième et troisième antennaires (figure 3B).
5. Différentes parties de l'antenne donnera accès à des types de sensilles différentes. Selon les besoins particuliers d'expérimentation, l'antenne devra être orienté différemment pour permettre l'accès à des types de sensilles différentes. Pour enregistrer à partir sensilles basiconic grandes comme dans notre exemple, l'Arista est poussé vers le bas sur le verre (figure 3B).

5. Insecte de préparation: Anopheles palpes maxillaires

1. Utiliser un aspirateur électrique (figure 2E), recueillir 40 à 60 moustiques 3-5 jours anciens (mâles et femelles mélangés) dans la cage en plastique de petite taille (figure 2F). Les moustiques doivent avoir été élevés dans des conditions normales, c'est à dire dans un insecte incubateur ou insectarium à 25-28 ° C avec une humidité de 70-80%. Placez la petite cage en plastique avec les animaux sur la glace pendant environ 15 min jusqu'à ce qu'ils soient anesthésiés par le froid. Une fois que les animaux ont cessé de bouger, de transfert de seulement 4-6 animaux à la scène sous le microscope à tout moment, en gardant le reste des animaux sur la glace pendant les procédures. Bien que les femelles sont généralement utilisés en raison de leur sensibilité au CO _2, les hommes peuvent aussi être employées. Sélectionnez les moustiques femelles ou des mâles, à en juger par la structure de leurs antennes (plume-comme chez les femelles, de filaments ressemblant à des hommes), et de supprimer leurs ailes et les jambes avec une pince fine pour les immobiliser. Gardez-les dans une petite tasse en plastique avec un papier humide en bas, pour les empêcher de dessécher.
2. Mettez deux morceaux de scotch double-face (~ 1 cm de longueur) en parallèle les uns aux autres (~ 1 cm de distance), au centre et sur le côté de la lame de verre (figure 3C). En utilisant des pinces fines, placez une moustiquaire sur la bande centrale sous la loupe binoculaire, et il se tourner de côté et le bâton de son corps et un œil sur la bande. Ajustez la position des palpes maxillaires afin que les deux palpes s'étendent parallèlement sur la bande (figure 3D). Fixer les palpes maxillaires en plaçant cordes fines (par exemple, les cheveux humains) à la fois à la base et à la pointe des palpes (figure 3D). La bande latérale est utilisée comme référentiel pour cordes fines, tandis que la bande centrale doit être remplacée après chaque enregistrement (figure 3C).

6. Enregistrement Drosophila melanogaster

1. Placer la lame sous le microscope (figure 4A) à faible grossissement et la position de l'antenne à peu près au milieu du champ de vision (FOV) (figure 4B). Abaissez délicatement les électrodes de telle sorte que l'électrode de référence est situé près de l'œil de la mouche et l'électrode d'enregistrement est près de l'antenne (figure 4C). Augmenter le grossissement et re-positionner l'antenne dans le milieu de la FOV (figure 4D).
2. Placez l'appareil près de l'odeur de livraison à la tête de la mouche, pointant à l'antenne.
3. A faible grossissement (figure 4C), insérez l'électrode de référence dans l'œil de la mouche. Basse l'électrode d'enregistrement sur le dessus de l'antenne sans toucher sa surface.
4. Le passage à fort grossissement, le contrôle de l'électrode d'enregistrement avec le micromanipulateur et l'insérer dans un sensillum sélectionnés (figure 4D). Tout point de la longueur sensillum est bon pour l'enregistrement. Une fois à l'intérieur du sensillum, l'électrode peut être poussé plus loin dans (parfois tout le long)d'obtenir un meilleur rapport signal sur bruit. Une fois que l'électrode est dans le sensillum, l'activité spontanée des cellules peut être détectée.

7. Enregistrement Anopheles gambiae

1. Placez la lame de verre sous le microscope à faible grossissement (10x) et la position des palpes maxillaires à peu près au milieu de la FOV et la tête en haut (figure 4E). Tourner la scène jusqu'à ce que l'un des palpes est à un angle droit avec l'électrode d'enregistrement.
2. Ajuster la hauteur des électrodes de telle sorte que l'électrode de référence est positionné juste au-dessus de l'œil du moustique et l'électrode d'enregistrement est proche des palpes maxillaires.
3. Placez le dispositif de délivrance d'odeurs afin qu'il soit aussi proche que possible de l'palpes.
4. Insérer l'électrode de référence dans l'œil à faible grossissement (10x), et le passage à l'plus fort grossissement (100x), insérez l'électrode d'enregistrement dans le sensillum PEG sur le palpe (Figure 4f). Une fois que l'électrode est dans le sensillum, l'activité spontanée des cellules peut être détectée.

8. Les résultats représentatifs

Selon le sensillum et la qualité de l'enregistrement, on peut distinguer un nombre différent de neurones olfactifs dans une seule trace. Dans la grande sensilles basiconic de Drosophila melanogaster, par exemple, entre 2 et 4 cellules qui diffèrent en pic d'amplitude devrait apparaître lors de l'enregistrement ^{9, 10.}

Dans notre expérience, la vidéo, la drosophile AB2 sensillum montre deux cellules, une. Une cellule (figure 5, les pointes bleu) et une cellule B (figure 5, les pointes vertes) Ni cellule est activée lors de l'application d'huile de paraffine (figure 5A), tandis que la cellule A répond à la dilution 10 ^-6 de l'acétate de méthyle (figure 5B).

Dans le palpe maxillaire d'Anopheles gambiae, le PEG rainuré sensillum contient trois cellules, mais seulement deux sont facilement discriminées (figure 5C, les pointes bleu et vert, respectivement). Dans l'expérience vidéo que nous montrent comment la cellule B répond à une dilution de 10 ^-7 1-octène-3-ol (figure 5D).

Figure 1. Electrode aiguiseur
(A) Vue générale de l'appareil d'électrode crayon. (B) La seringue contenant 0,5 M de KOH (à gauche) sert à affûter les électrodes (à droite). (C) Gros plan sur l'extrémité de l'électrode à côté de l'ouverture de la seringue.

Figure 2. Comment préparer un aspirateur mouche et moustique aspirateur
(A) de départ:... Tubes en plastique conduite d'air, deux embouts de pipette couper, et maillage (B) L'aspirateur volée une fois qu'elle est terminée (C) Détail de la fin qui est utilisé pour attraper des mouches du vinaigre (D) Détail de l'autre extrémité de l'aspirateur voler. (E) L'aspirateur électrique pour la collecte des moustiques se compose d'un corps principal et une cage en plastique amovible (F). La cage amovible en plastique pour les moustiques.

Figure 3. Préparer une mouche du vinaigre (Drosophila melanogaster) et un moustique du paludisme (Anopheles gambiae) pour l'enregistrement
(A) Image d'un vinaigre volée monté sur la glissière avant de positionnement sous le microscope. (B) Gros plan sur la tête mouche du vinaigre avec l'antenne maintenu en place par le capillaire en verre. (C) Photo d'un moustique montées sur la diapositive. (D) Gros plan sur la tête des moustiques avec des trompe et palpes coller sur la bande.

Figure 4. Enregistrement à partir d'une mouche du vinaigre (Drosophila melanogaster) et un moustique du paludisme (Anopheles gambiae)
(A) Vue de l'installation de l'électrophysiologie. (B) Gros plan sur la préparation volée montée sur le microscope. Notez la position respective de l'électrode d'enregistrement (à gauche), le système de livraison d'odeur (milieu pipette), et l'électrode d'enregistrement (à droite). (C) image de la mouche sous l'objectif 10x. (D) image de l'antenne voler sous l'objectif 100x;. sensilles grande basiconic (flèches), entrecoupées parmi les non-sensorielle poils (flèches) (E) vue 10x d'un moustique montées pour l'enregistrement (F) Vue à fort grossissement de la palpe les moustiques et un sensillum PEG (flèche). .

Figure 5. Exemples d'enregistrements de Drosophila melanogaster etAnopheles gambiae
(A) Le sensillum AB2 de Drosophila melanogaster abrite deux neurones sensoriels;.. La Une cellule (pointes bleu) et des cellules B (pics verts) (B) Les cellules A et B lors de l'application de 10 ^-6 acétate de méthyle (C) L' peg sensillum d'Anopheles gambiae abrite deux neurones sensoriels, les cellules A (pointes de bleu) et des cellules B (pics vert) (D) Application de 10 ^-7 1-octène-3-ol à l'sensillum PEG..