The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan-Ann Arbor
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 54.234.67.55, User IP: 54.234.67.55, User IP Hex: 921322295
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Klocko, A. D., Crafton, K. M., Walsh, B. W., Lenhart, J. S., Simmons, L. A. Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (36), e1736, doi:10.3791/1736 (2010).
גידול תרביות של תאים עבור מיקרוסקופיה
1. אחד או יומיים לפני ההדמיה, להכין את B. subtilis זן המכיל את החלבון היתוך translational אתם רוצים לדמיין. סיבובים משפט 1A ו-1B צעדים יהיה צורך לקבוע אילו תנאי גידול מספק את התמונות הטובות ביותר של זן שלך. ברוב המקרים, התאים צריכים להיות צילמו במהלך שלב הצמיחה המעריכית.
2. בבוקרו של הדמיה, מקום 10 מ"ל של מדיום 50 S7 1-3 לתוך בקבוק 125 מ"ל Erlenmeyer סטרילי.
3. Resuspend התאים עד 2 מ"ל של מדיום 50 S7 מהצלחת LB אגר עם מושבות יחיד או בתאי אור ומחוברות להשיג inoculum.
4. הוסף מספיק S7 50 בינוני תא inoculum אל הבקבוק המכיל 10 מ"ל Erlenmeyer S7 50 בינוני תרבות עם צפיפות אופטית הראשונית נמדד ב 600 nm (OD 600) של ~ 0.08-0.1. בשלב זה חשוב לי לפחות אוויר של פי 10 יחס בינוני. לפיכך, אנו משתמשים 10-12.5 מ"ל של מדיום מחוסן בתוך בקבוק 125 מ"ל Erlenmeyer.
5. לגדול בכל תרבות ב 30 ° C עד התרבות מגיע OD 600 ~ 0.5-0.8. אמבטיות מים רועד עדיפים עם סיבובים לדקה 150-200. תרבויות תיגר עם סוכני ה-DNA אי התאמה או גרימת נזק צריך להיות בשלב מוקדם הצמיחה המעריכית OD 600 תאים כאלה יגיעו ליעד OD 600 לתקופה נוספת של צמיחה הנדרש לטיפול (ראה לוח 1)
לדוגמה, 2-aminopurine דורש שעה אחת של טיפול, ולכן תרבות שטופלו aminopurine-2 צריך להיות 600 ~ OD 0.3-0.4, כך שעה אחת של טיפול / תוצאות הצמיחה OD 600 ~ 0.5-0.8, לפיו תאים מוכנים הדמיה.
לדוגמא הכנה
1. פיפטה 300 μl של תאים בתרבית לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
2. אם הדמיה של ממברנות הסלולר הוא הרצוי, להוסיף 1:1000 דילול של קרום FM4-64 כתם (Invitrogen) לדגום כל מפתרון מ"ג / מ"ל 1 המניות. טיטרציה של FM4-64 עשויים להידרש כדי להשיג את אותות הקרינה הרצויה. מגוון טיטרציה טיפוסית היא 1:100, 1:1000, ו 1:10,000.
3. אפשר הדגימות לשבת בטמפרטורת החדר לתקופה של עד עשר דקות או בעוד שקופית מכינים עם agarose 1% בטווח הבינוני Spizizens 1X כמתואר להלן (ראה שלב 1 של "הכנת שקופית").
4. אם ריכוז של התאים נדרשת, אנו מעדיפים תאים סינון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר עם מנגנון ואקום. תאים לאחר מכן ניתן לשטוף בעדינות מפני השטח של המסנן עם PBS, עוד חיץ מתאים או בינוני לפני להדמיה.
הכנת שקופיות
1. הכן agarose 1% עם 1X Spizizens.
הוסף 5 מ"ל של המניה Spizizens 10X ל 45 מ"ל ddH2O יחד עם 0.5 גרם agarose, ומיקרוגל להינמס. Agarose מותכת חמה קשה פיפטה, ביסוס agarose לא ייכנסו קצה פיפטה. Agarose צריך להיות equilibrated באמבט מים בטמפרטורה של 55-65 ° C ~ את זה כדי להזין את קצה פיפטה ללא לחיזוק בתוך טיפ.
2. צייר 20 μl של Spizizens עם agarose מומסת 1% אל קצה פיפטה. פיפטה טיפה אחת (כ 1-2 μL) של הפתרון agarose לתוך שקופית היטב (אנחנו משתמשים גם 15 שקופיות, ראה טבלה 2) כדי ליצור רדוד רפידות agarose. Agarose יהיה לגבש באופן מיידי. שקופיות חייב להיות גם מיד לפני יישום של התאים. אם כריות agarose נותרים בטמפרטורת החדר לבד, הם יכולים תוך דקות מייבשים ולהיות שמיש.
רפידות agarose צריך להיות מרוכז ומלא כל טוב אבל יש גובה מינימום כדי למנוע שיבוש coverslip, אם הטיפות הן גבוהות מדי (כמו בועה) או אם המדגם מתפשט גם מעבר לגבול, פשוט לסחוב לנקות היטב עם Kimwipe ולהחיל חדש agarose כרית.
3. החל המדגם כולו 300 μl (ראה שלב 6) לשקופית, מופץ על החלק העליון של כל משטח agarose. זו כמות של תאים אמור להיות מספיק כדי לכסות את כל טוב בשקופית.
4. אפשר להחליק עמוסה התאים לשבת בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס) במשך כ עשר דקות. צעד זה יאפשר את התאים להתיישב על כרית agarose להיות נייח ומוכן הדמיה. עבור צרכים מיוחדים בטמפרטורה זו ייתכן שיהיה צורך לשנות, למשל, בעת ביצוע הניסויים הדורשים שינוי הטמפרטורה 4.
5. לשאוב משם את המדיום עודף גם מבלי להסיר את כל הרפידות עצמם.
6. החל את coverslip לשקופית, לחיצה בחוזקה ובאופן שווה, אבל בעדינות, על פני שטח של השקופית. ודא כי להחליק כיסוי נגד לשקופית וכי להחליק לכסות לא עולה מעל השקופית.
ויזואליזציה של תאים
1. רבים מיקרוסקופים פלואורסצנציה שונים יעבדו היטב. זה קריטי יש עדשה 100x טבילה שמן. המעבדה סימונס משתמש:
2. תביאו את התאים אל המוקד באמצעות אור לבן.
3. צלמו את התמונה באמצעות מסננים מתאים fluorophore כל אחד.
נציג תוצאות
תמונות נציג מוצגים (איור 1). GFP מוקדים צריך להיות מוגדר היטב, בעוד FM4-64 מכתים צריך להיות בהיר 4-7. תמונות GFP או קרום יכול להיות פסאודו בצבע עם כל צבע, על מנת לאפשר את התמונה באיכות הגבוהה ביותר שיוצגו מבלי לאבד נתונים.
איור 1: תמונות GFP נציג B. subtilis חלבונים היתוך translational. חלבוני ה-GFP מוצגים ירוק, בעוד מכתים FM4-64 ממברנה מוצג באדום. סרגל סולם לבן מציין 3 מיקרומטר (א) MutS-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: mutS - GFP (SPC), amyE: Pspac mutL (חתול)]. בנוכחותו של 600 מיקרוגרם / מ"ל 2-aminopurine ו IPTG 1 מ"מ. FM4-64 אות לא מוצגת על מנת להראות בצורה ברורה יותר MutS-GFP מוקדים (ב) MutL-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: mutL: mutL-GFP (SPC)].. בנוכחות aminopurine-2 (C) DnaX-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: dnaX: dnaX-GFP (SPC)]. (ד) RecA-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: recA: recA-GFP (SPC)] בנוכחות של 20 ng / mL mitomycin ג (E) TagC-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: tagC: tagC-GFP (SPC) ] בנוכחות של 1 מיקרוגרם / מ"ל mitomycin ג
| טיפול / ריכוז או כמות | פונקציה | זמן הדגירה של |
| Mitomycin C (MMC) [20-150 ng / mL] | סוכן ה-DNA אלקילציה | 1 שעה |
| 2-aminopurine (2-AP) [600 מיקרוגרם / מ"ל] | גרימת אי התאמה | 1 שעה |
| Hydroxyurea (האוניברסיטה העברית) | מכלה dNTPs | 3 שעות |
| אור אולטרה סגול (UV) 20 J/m2 | תימין, תימין הדימרים ו 6-4 photoproducts | משתנה בהתאם למקור, בדרך כלל 20 שניות |
| אפור (קרינה מייננת) 5-100 Gy | גדיל שוברת פעמיים, הפסקות גדיל יחיד נזק אתרי בסיס | משתנה בהתאם למקור |
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| שקופית Multitest, 15-היטב | MP Biomedicals | 6041505E | |
| כיסוי זכוכית מיקרוסקופ | דיג | 12-544-B | |
| Agarose | דיג | BP160-500 | |
| Mitomycin C | סיגמא | M0503-2MG | mutagen, ללבוש כפפות |
| 2-Aminopurine | סיגמא | A3509-טבליות של 250 | כפפות |
| Hydroxyurea | סיגמא | H8627-25 גרם | כפפות |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | אור רגיש |
טבלה 2. רשימת ריאגנטים ספציפיים ציוד:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
ניסוי וטעייה נדרשים למצוא את התנאים החשיפה לתמונות באיכות הגבוהה ביותר עבור כל זן, אנו מוצאים כי 1 אלפית השנייה מתאים תמונות אור לבן, תוך חשיפה של 100-2000 ms המתאימים GFP (FITC) ו FM4-64 (TRITC ) תמונות. זמן חשיפה ישתנו בהתאם לציוד הדמיה בשימוש. אנו ממליצים להשתמש זן אחד לכל שקופית 15 גם מיקרוסקופ הדמיה הפשוטה ביותר, כמו איכות פנקס דיפוזיה של תאים מהגבול כרית עלולה לסבך בידול זן אם זנים רבים נמצאים בשקופית אחת. איכות תמונה ישירות תלוי באיכות של כרית agarose שבו החיידקים נחים. התמונות באיכות הגבוהה ביותר יהיה שנתפסו מ agarose רפידות שבו חיידקים נמצאים זה לצד זה. רפידות שגורמים תאים חיידקיים אל סבך, מניעת monolayer, תפיק תמונות עניים. רפידות כי הם עבים מדי יפיק אות רקע גבוה פלורסנט, בעוד רפידות כי הם לא יאפשרו מיובש עבור התאים לנוח כמו שצריך. אלה כרית פגמים agarose יהיה בדרך כלל תוצאה של איכות תמונה גרועה מאוד. אם גם הוא לייצר דימויים עני, פשוט לעבור הבא היטב. הוא אידיאלי כדי ללכוד את בין 50 ל 200 תאים לכל תמונה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי סיפקה שפע של מידע המפרט את הרמזים הסלולר לכוון את הרכבה של תיקון דנ"א וחלבונים שכפול לתוך מוקדי in vivo. בעזרת תרגול, טכניקה זו יכולה להיות מיושם בהצלחה במגוון רחב של קומפלקסים חלבונים במינים חיידקים רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
המחברים מבקשים להודות בני הזוג. Philina ס לי אלן ד גרוסמן עבור בתחילה הכשרה LAS ב מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המחברים מודים גם בני הזוג. מלאני Berkmen ו האג'ימה קוביאשי לעזרה וטיפים הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי הזנק וקרנות מהמכללה, ספרות מדע אמנות מהמחלקה לביולוגיה מולקולרית, נייד, ו התפתחותית באוניברסיטת מישיגן.
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
|||
| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
|||
| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
|||
| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
