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 JoVE Biology

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte I: La lignina

1, 1, 2

1Great Lakes Bioenergy Research Center, Michigan State University (MSU), 2Great Lakes Bioenergy Research Center and DOE-Plant Research Lab, Michigan State University (MSU)

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    La biomasa vegetal es uno de los principales de carbono-neutral recurso renovable que podría ser utilizado para la producción de biocombustibles. La biomasa vegetal se compone principalmente de las paredes celulares, un material compuesto estructuralmente complejos denomina lignocelulosa. Aquí se describe un protocolo para un análisis exhaustivo del contenido y la composición de la lignina polifenólicos.

    Date Published: 3/11/2010, Issue 37; doi: 10.3791/1745

    Cite this Article

    Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin. J. Vis. Exp. (37), e1745, doi:10.3791/1745 (2010).

    Abstract

    La necesidad de renovables, neutral de carbono y sostenible de materias primas para la industria y la sociedad se ha convertido en uno de los problemas más acuciantes para el siglo 21. Esto ha reavivado el interés en el uso de productos vegetales como materia prima industrial para la producción de combustibles líquidos para el transporte

    Protocol

    1. El aislamiento de la pared celular

    1. Moler aproximadamente el 60-70mg de aire o de material liofilizado de plantas, con 5,5 mm bolas de acero inoxidable en un tubo de 2 ml tapa Sarstedt tornillo con un iWall, un robot de molienda y dosificación (30 s). Una alternativa no robótica de bajo rendimiento con un procedimiento de molienda (retschmill) se presenta en la Parte II 2.
    2. Añadir 1,5 ml de etanol al 70% acuoso para el material molido dispensado, y agitar bien.
    3. Centrifugar a 10.000 rpm durante 10 minutos para que sedimenten los residuos insolubles en alcohol.
    4. Aspirar o decantar el sobrenadante.
    5. Añadir 1,5 ml de cloroformo / metanol (1:1 v / v) al residuo y agitar el tubo a fondo para volver a suspender el pellet
    6. Centrifugar a 10.000 rpm durante 10 minutos y Aspirar o decantar el sobrenadante.
    7. Resuspender el pellet en 500 l de acetona.
    8. Se evapora el disolvente con una corriente de aire a 35 ° C hasta que se seque.
      Si es necesario muestras secas se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta su posterior procesamiento.
    9. Para iniciar la extracción del almidón de la muestra resuspender el precipitado en 1,5 ml de un 0,1 M de acetato de sodio pH 5,0 tampón.
    10. Tape los tubos Sarstedt y el calor durante 20 minutos. a 80 ° C en un calentador.
    11. Se enfría la suspensión en el hielo.
    12. Añadir los siguientes agentes de la pastilla: 35 l de 0,01% de azida sódica (NaN3), 35 l de amilasa (50 mg / ml H 2 O, a partir de especies de Bacillus, Sigma), 17 pululanasa l (17,8 unidades de acidopullulyticus Bacillus; Sigma) . Tape el tubo y agitar bien.
    13. La suspensión se incubó durante la noche a 37 ° C en la coctelera. La orientación de los tubos horizontales ayudantes mejor mezcla.
    14. Suspensión de calor a 100 º C durante 10 min en un calentador de terminar la digestión.
    15. Centrifugar (10.000 rpm, 10 min) y eliminar el sobrenadante que contiene almidón solubilizado.
    16. Lave el resto de pellet tres veces mediante la adición de 1,5 ml de agua, agitación, centrifugación y decantación del agua de lavado.
    17. Resuspender el pellet en 500 l de acetona.
    18. Se evapora el disolvente con una corriente de aire a 35 ° C hasta que se seque. Puede ser necesario también para romper el material en el tubo con una espátula para un mejor secado.
      El material seco se presenta de la pared celular aislado (lignocelulosa). Si es necesario muestras secas se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta su posterior procesamiento.

    2. Contenido de lignina

    Este método se basa en un método reportado por Fukushima y Hatfield 3.

    1. Pesar 1 a 1,5 mg de material preparado de la pared celular (ver 1) en 2 ml matraz aforado de salir de un tubo vacío de un espacio en blanco.
    2. enjuagar las paredes del tubo con 250 l de acetona para recoger el material de la pared celular en la parte inferior del tubo, y se evapora la acetona muy suave en el flujo de aire.
    3. Suavemente añadir 100 ml de solución recién hecha bromuro de acetilo (25% v / v bromuro de acetilo en ácido acético glacial) a lo largo de las paredes del tubo para evitar salpicaduras.
    4. Cap matraz aforado y se calienta a 50 ° C durante 2 horas
    5. El calor durante una hora adicional con agitación cada 15 minutos.
    6. Dejar enfriar en hielo a temperatura ambiente.
    7. Añadir 400 l de hidróxido de sodio 2M y 70 l de recién preparada clorhidrato de 0,5 M de hidroxilamina. Vortex matraces aforados.
    8. Rellene matraz aforado exactamente a la marca de 2,0 ml con ácido acético glacial, tapa e invierta varias veces para mezclar.
    9. Pipetear 200 l de la solución en una placa de 96 UV específicos bien y leer en un lector de ELISA a 280 nm.
    10. Determinar el porcentaje de lignina bromuro de acetilo soluble (% ABSL) mediante un coeficiente que corresponda (Álamo = 18,21; Pastos = 17,75; Arabidopsis = 15.69) con la siguiente fórmula:
      % ABSL Calc: Figura 1

      Multiplicación de ABSL% con 10 resultados en la unidad de la célula ug / mg pared

      Ayuda a hacer por lo menos tres placa se lee en un promedio de la absorbancia (ABS), ya que las partículas pueden causar una ligera variación en los valores de absorbancia. Nota: 0.539 cm representa el paso de luz, pero dependiendo de la placa de la que tenga que determinar.

    3. Lignina Composición

    Este método se adoptó a partir de un método reciente publicado por Robinson y Mansfield 5.

    1. Transferencia de aproximadamente 2 mg de material de la pared celular (ver 1.) En un tubo de vidrio cubiertas de tornillo para tioacidolisis.
    2. preparar cuidadosamente el 2,5% de trifluoruro de boro dietil eterato (BF 3), el 10% etanotiol (EtSH) solución. Debe utilizar un globo lleno de gas nitrógeno para desplazar el volumen perdido en la botella de dioxano con nitrógeno. El dioxano es muy peligroso, no tomar muestras o equipos fuera de la campana. Volúmenes necesarios para la preparación de la solución por muestra: 175 l dioxano, 20 EtSH l, 5 l BF 3.
    3. Añadir 200 l de EtSH, BF 3, la solución de dioxano para cada muestra.
    4. Purga del espacio de cabeza del vial con gas nitrógeno y la tapa inmediatamente.
    5. El calor a 100 º C durante 4 horas con agitación suave cada hora.
    6. Final de la reacción por enfriamiento en hielo durante 5 minutos.
    7. Añadir 150 ml de bicarbonato de sodio 0,4 M, vortex
    8. Para la limpieza se añade 1 ml de agua y 0,5 ml de acetato de etilo vórtice, y dejar separar las fases (acetato de etilo en la parte superior, el agua en la parte inferior).
    9. Transferencia de 150 ml de la capa de acetato de etilo en un tubo de 2 ml Sarstedt. Asegúrese de que el agua no se transfiere.
    10. Evaporar el solvente por un concentrador de aire.
    11. Añadir 200 l de acetona y se evapora (repetición de un total de dos veces quitar el exceso de agua).
    12. Para la derivación TMS añadir 500 l de acetato de etilo, 20 l de piridina, y 100 l de N, O-bis (trimetilsilil) acetamida a cada tubo.
    13. incubar durante 2 horas a 25 ° C.
    14. Transferencia de 100 l de la reacción en un vial de GC / MS y añadir 100 ml de acetona.
    15. Analizar las muestras por GC equipado con un espectrómetro de masas cuadrupolo o detector de ionización de llama. Un Agilent HP-5MS columna se instala (30 mm X 0.25 mm X 0,25 m espesor de la película). El gradiente de temperatura se utiliza la siguiente con un retraso de 30 minutos disolvente y un 1,1 ml / min de caudal: retención inicial a 130 ° C durante 3 minutos, a 3 ° C / min a una rampa de 250 ° C y mantener durante 1 min, permiten el equilibrio de la temperatura inicial de 130 ° C.
    16. Picos se identifican con tiempos de retención relativos con tetracosane patrón interno (opcional) o mediante iones característicos espectro de masas de 299 m / z, 269 m / z, y 239 monómeros m / z de S, G y H, respectivamente (ver fig. 2). La composición de los componentes de la lignina se cuantifica mediante la creación del área del pico total de 100%

    4. Resultados representante

    Un ejemplo de un análisis de la pared se presenta en la Figura 2. En este caso, el álamo madre (de madera) fue analizada por los diversos procedimientos descritos en la sección de protocolo. Un cromatograma de ejemplo de la separación de la lignina, componentes después de tioacidolisis y derivación TMS-se muestra. Claramente, la abundancia relativa de syringyl-(S), guayacil (G), y p-hidroxifenol-(H) unidades se puede determinar. El contenido de lignina soluble bromuro de acetilo se explica por sí mismo, se puede esperar que los valores de entre el 20-50% del peso seco de la pared. Hay que señalar que el bromuro de acetilo no solubilizar todos los presentes la lignina en la pared, y que el grado de solubilización puede variar dependiendo del material. Sin embargo, este método es relativamente fácil de realizar y rápido y da una excelente aproximación del contenido de lignina en un material lignocelulósico.

    Figura 1
    Figura 1:. Visión general del análisis lignocelulósicos paredes celulares (lignocelulosa) están aislados de material en bruto de plantas secas. El material de la pared se pondera en alícuotas y se divide para los ensayos de varios. Material de la pared se trata con bromuro de acetilo y la lignina solubilizada cuantificado por espectroscopia UV-. Para la determinación de la composición de la lignina, el material de la pared se somete a tioacidolisis. Los compuestos fenólicos solubilizados someterse a la derivación TMS y luego pueden ser separados y cuantificados por análisis GC-MS. La composición de polisacáridos de la matriz y el protocolo de celulosa cristalina contenido se discute en la Parte II 2.

    Figura 2
    Figura 2:. Análisis exhaustivo lignocelulósicos de la madera de álamo, Astillas de madera de álamo (Populus tremoloides) fueron sometidos a los protocolos descritos.
    Ligin composición; H p-hidroxifenil; G guayacil; S syringyl unidades.

    Discussion

    Los métodos descritos permiten una rápida evaluación cuantitativa del contenido de lignina y la composición de la biomasa de plantas lignocelulósicas. El uso del robot iWall aproximadamente 350 muestras de suelo y puede ser dispensado por día. El rendimiento de los distintos métodos de análisis por persona varía. Utilizando los protocolos descritos aquí, 30 muestras se pueden procesar por el contenido de lignina, y 15 para la composición de la lignina por día. Debido a la naturaleza cuantitativa de los cultivos de materias primas de datos óptima, variedad o genotipos pueden ser evaluados en términos de su idoneidad para la producción de biocombustibles.

    Disclosures

    Acknowledgements

    Estamos muy agradecidos a Mateo Robert Weatherhead de excelente servicio técnico y John Ralph, de la Universidad de Wisconsin, por sus valiosos consejos, discusiones, y la muestra de madera de álamo. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Energía de EE.UU. (DOE) de los Grandes Lagos del Centro de Investigación de Bioenergía (DOE BER Oficina de Ciencia-DE-FC02 07ER64494) y por las Ciencias Químicas, Geociencias y Ciencias Biológicas de la División de la Oficina de Ciencias Básicas de Energía, Oficina de Ciencia , EE.UU. Departamento de Energía (sin premio. DE-FG02-91ER20021).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Hydroxylamine Hydrochloride Sigma-Aldrich 255580
    Acetyl Bromide Aldrich 135968
    Ethanethiol Sigma-Aldrich E3708
    Borontrifluoride diethyl etherate Fluka 15719
    N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide Fluka 15241
    Dioxane Sigma-Aldrich 296309
    Spectromax Plus 384 Molecular Devices Plus384
    GC-MS Agilent Technologies 6890 GC/5975B MSD (lignin composition)
    5.5mm Stainless Steel Balls Salem Ball Company (N/A)
    96 well plate heat spreader Biocision Coolsink 96F
    Heating block Techne Dri-block DB-3D
    Sample concentrator Techne FSC400D

    References

    1. Carroll, A., and Somerville, C. "Cellulosic Biofuels,". Annual Review of Plant Biology 60, 165 (2009).
    2. Foster, C.E., Martin, T., Pauly, M. "Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates". Journal of Visualized Experiments (2010).
    3. Fukushima, R. S., and Hatfield, R. D. "Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method,". J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133 (2001).
    4. Pauly, M., and Keegstra, K. "Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels,". Plant J. 54(4), 559 (2008).
    5. Robinson, A. R., and Mansfield, S. D. "Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling,". Plant J. 58(4), 706 (2009).
    6. Somerville, C., et al., "Toward a systems approach to understanding plant-cell walls,". Science. 306 (5705), 2206 (2004).
    7. Teeri, T. T., and Brumer, H. "Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases,". Biocatalysis and Biotransformation. 21 (4-5), 173 (2003).

    Comments

    8 Comments

    Erratum: Please note that acetyl-bromide (Lignin content; 3) under the conditions described solubilizes lignin as a polymer with very little degradation to monolignols. This is contrary to what is said in the video.
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 13, 2010, 8:06 PM

    Congratulations by the clear description of a high troughput method. It will be very usefull to our work in lignocellulose characterization in sugarcane. I still have some doubts about how good is the method compared to pyrolysis-GC-MS method we are running, were we can quantitate about ²0 different molignols. We have purified lignin sample that we previously analyse the pyr-GC-MS. If you are interested, I will be glad to provide you
    Reply

    Posted by: Marcelo Ehlers L.July 21, 2010, 7:59 PM

    Hello,
    I work in University of Poitiers (France). Thank you for your good work. I would like solubilise the Lignin for analyse it with MALDI-TOF. I have a question. If i use Acetyl-Bromide, i will break the molecule of Lignin or no ? Thanks for your answer.
    Best regards.
    M-TARIGHI
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 23, 2012, 5:48 AM

    Hello, thanks for the comments. The acetyl bromide soluble lignin assay is said to solubilize the lignin rather than break it down. There is a paper from Hatfield and Fukushima ( http://agdb.nal.usda.gov/bitstream/10113/3²68/1/IND43704044.pdf) that briefly discuss the structure of the lignin after the acetyl bromide treatment. Best of luck!

    Cliff
    Reply

    Posted by: Cliff F.January 23, 2012, 10:42 AM

    Hello;
    I'm a master student working at the university of Copenhagen. I've a question about the cell wall isolation in the part one of the protocol: I tried to grind my samples ( barley straw ) following literally your protocol ( so straw in plastic vials, grinding balls inside ecc). I didn't used any robot just a grinding machine. At the end I obtained some samples in a very fine podwer but in others the powder was just bulked on the bottom of the vial in a quite hard layer. I broke it up for the lignin quantification. I was wondering if that can bring some trouble during the analysis. I really don't know how that's happen.
    Reply

    Posted by: gianluca b.January 24, 2014, 7:04 AM

    Hi. Just to clarify, did this happen before or after the cell wall extractions? When you dry the biomass at the end of the starch removal process, you might get a recalcitrant pellet but that depends on the tissue type. We mainly see this occur with leaf tissue that is low in quantity (maybe around 10 mg or less) so to avoid this, we make sure to start with 60-70 mg of dry tissue.
    Reply

    Posted by: Cliff F.January 24, 2014, 10:20 AM

    For the Lignin monomers (S,G, and H), what chemicals would I use for making standards?? I've ran a few of my TMS derivitized samples through GC/MS and am not getting any peaks. Before I determine if I need to re-do the experiment I would like to run some standards at different concentrations. Please let me know!

    Thanks,
    Emily
    Reply

    Posted by: Emily G.September 3, 2014, 1:04 PM

    Hi Emily. The lignin monomer standards are not commercially available so they need to be synthesized if you want to use them. John Ralph had a recent publication outlining the synthesis (J. Agric. Food Chem., 2012, 60 (4), pp 922–928) and use of the thioacidolysis monomers. They included internal standard response factors for GC-MS and GC-FID so if synthesis is out of the question, you could make due with their measurements.

    One important note is that since the publication, we have found that the biomass to thioacidolysis reaction mixture volume can impact the monomer yield. Now that we have the synthetic standards, we can track this phenomenon a lot better and have made a small adjustment to the initial reaction volume. We now use 1ml of reaction mixture with 2mg of biomass. This biomass to reaction mixture volume seems to maximize the monomer yields and we don't see the blackening of the biomass anymore (which sometimes would happen). Hopefully this will help! If you want to discuss the method in any more detail feel free to send me an email (foster54@msu.edu).
    Reply

    Posted by: Cliff F.September 4, 2014, 3:49 PM

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