Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte I: La lignina

1. El aislamiento de la pared celular

1. Moler aproximadamente el 60-70mg de aire o de material liofilizado de plantas, con 5,5 mm bolas de acero inoxidable en un tubo de 2 ml tapa Sarstedt tornillo con un iWall, un robot de molienda y dosificación (30 s). Una alternativa no robótica de bajo rendimiento con un procedimiento de molienda (retschmill) se presenta en la Parte II ^2.
2. Añadir 1,5 ml de etanol al 70% acuoso para el material molido dispensado, y agitar bien.
3. Centrifugar a 10.000 rpm durante 10 minutos para que sedimenten los residuos insolubles en alcohol.
4. Aspirar o decantar el sobrenadante.
5. Añadir 1,5 ml de cloroformo / metanol (1:1 v / v) al residuo y agitar el tubo a fondo para volver a suspender el pellet.
6. Centrifugar a 10.000 rpm durante 10 minutos y Aspirar o decantar el sobrenadante.
7. Resuspender el pellet en 500 l de acetona.
8. Se evapora el disolvente con una corriente de aire a 35 ° C hasta que se seque.
   Si es necesario muestras secas se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta su posterior procesamiento.
9. Para iniciar la extracción del almidón de la muestra resuspender el precipitado en 1,5 ml de un 0,1 M de acetato de sodio pH 5,0 tampón.
10. Tape los tubos Sarstedt y el calor durante 20 minutos. a 80 ° C en un calentador.
11. Se enfría la suspensión en el hielo.
12. Añadir los siguientes agentes de la pastilla: 35 l de 0,01% de azida sódica (NaN3), 35 l de amilasa (50 mg / ml H ₂ O, a partir de especies de Bacillus, Sigma), 17 pululanasa l (17,8 unidades de acidopullulyticus Bacillus; Sigma) . Tape el tubo y agitar bien.
13. La suspensión se incubó durante la noche a 37 ° C en la coctelera. La orientación de los tubos horizontales ayudantes mejor mezcla.
14. Suspensión de calor a 100 º C durante 10 min en un calentador de terminar la digestión.
15. Centrifugar (10.000 rpm, 10 min) y eliminar el sobrenadante que contiene almidón solubilizado.
16. Lave el resto de pellet tres veces mediante la adición de 1,5 ml de agua, agitación, centrifugación y decantación del agua de lavado.
17. Resuspender el pellet en 500 l de acetona.
18. Se evapora el disolvente con una corriente de aire a 35 ° C hasta que se seque. Puede ser necesario también para romper el material en el tubo con una espátula para un mejor secado.
    El material seco se presenta de la pared celular aislado (lignocelulosa). Si es necesario muestras secas se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta su posterior procesamiento.

2. Contenido de lignina

Este método se basa en un método reportado por Fukushima y Hatfield 3.

1. Pesar 1 a 1,5 mg de material preparado de la pared celular (ver 1) en 2 ml matraz aforado de salir de un tubo vacío de un espacio en blanco.
2. enjuagar las paredes del tubo con 250 l de acetona para recoger el material de la pared celular en la parte inferior del tubo, y se evapora la acetona muy suave en el flujo de aire.
3. Suavemente añadir 100 ml de solución recién hecha bromuro de acetilo (25% v / v bromuro de acetilo en ácido acético glacial) a lo largo de las paredes del tubo para evitar salpicaduras.
4. Cap matraz aforado y se calienta a 50 ° C durante 2 horas
5. El calor durante una hora adicional con agitación cada 15 minutos.
6. Dejar enfriar en hielo a temperatura ambiente.
7. Añadir 400 l de hidróxido de sodio 2M y 70 l de recién preparada clorhidrato de 0,5 M de hidroxilamina. Vortex matraces aforados.
8. Rellene matraz aforado exactamente a la marca de 2,0 ml con ácido acético glacial, tapa e invierta varias veces para mezclar.
9. Pipetear 200 l de la solución en una placa de 96 UV específicos bien y leer en un lector de ELISA a 280 nm.
10. Determinar el porcentaje de lignina bromuro de acetilo soluble (% ABSL) mediante un coeficiente que corresponda (Álamo = 18,21; Pastos = 17,75; Arabidopsis = 15.69) con la siguiente fórmula:
    % ABSL Calc:
    
    Multiplicación de ABSL% con 10 resultados en la unidad de la célula ug / mg pared
    
    Ayuda a hacer por lo menos tres placa se lee en un promedio de la absorbancia (ABS), ya que las partículas pueden causar una ligera variación en los valores de absorbancia. Nota: 0.539 cm representa el paso de luz, pero dependiendo de la placa de la que tenga que determinar.

3. Lignina Composición

Este método se adoptó a partir de un método reciente publicado por Robinson y Mansfield ^5.

1. Transferencia de aproximadamente 2 mg de material de la pared celular (ver 1.) En un tubo de vidrio cubiertas de tornillo para tioacidolisis.
2. preparar cuidadosamente el 2,5% de trifluoruro de boro dietil eterato (BF ^3), el 10% etanotiol (EtSH) solución. Debe utilizar un globo lleno de gas nitrógeno para desplazar el volumen perdido en la botella de dioxano con nitrógeno. El dioxano es muy peligroso, no tomar muestras o equipos fuera de la campana. Volúmenes necesarios para la preparación de la solución por muestra: 175 l dioxano, 20 EtSH l, 5 l BF ^3.
3. Añadir 200 l de EtSH, BF ^3, la solución de dioxano para cada muestra.
4. Purga del espacio de cabeza del vial con gas nitrógeno y la tapa inmediatamente.
5. El calor a 100 º C durante 4 horas con agitación suave cada hora.
6. Final de la reacción por enfriamiento en hielo durante 5 minutos.
7. Añadir 150 ml de bicarbonato de sodio 0,4 M, vortex
8. Para la limpieza se añade 1 ml de agua y 0,5 ml de acetato de etilo vórtice, y dejar separar las fases (acetato de etilo en la parte superior, el agua en la parte inferior).
9. Transferencia de 150 ml de la capa de acetato de etilo en un tubo de 2 ml Sarstedt. Asegúrese de que el agua no se transfiere.
10. Evaporar el solvente por un concentrador de aire.
11. Añadir 200 l de acetona y se evapora (repetición de un total de dos veces quitar el exceso de agua).
12. Para la derivación TMS añadir 500 l de acetato de etilo, 20 l de piridina, y 100 l de N, O-bis (trimetilsilil) acetamida a cada tubo.
13. incubar durante 2 horas a 25 ° C.
14. Transferencia de 100 l de la reacción en un vial de GC / MS y añadir 100 ml de acetona.
15. Analizar las muestras por GC equipado con un espectrómetro de masas cuadrupolo o detector de ionización de llama. Un Agilent HP-5MS columna se instala (30 mm X 0.25 mm X 0,25 m espesor de la película). El gradiente de temperatura se utiliza la siguiente con un retraso de 30 minutos disolvente y un 1,1 ml / min de caudal: retención inicial a 130 ° C durante 3 minutos, a 3 ° C / min a una rampa de 250 ° C y mantener durante 1 min, permiten el equilibrio de la temperatura inicial de 130 ° C.
16. Picos se identifican con tiempos de retención relativos con tetracosane patrón interno (opcional) o mediante iones característicos espectro de masas de 299 m / z, 269 m / z, y 239 monómeros m / z de S, G y H, respectivamente (ver fig. 2). La composición de los componentes de la lignina se cuantifica mediante la creación del área del pico total de 100%

4. Resultados representante

Un ejemplo de un análisis de la pared se presenta en la Figura 2. En este caso, el álamo madre (de madera) fue analizada por los diversos procedimientos descritos en la sección de protocolo. Un cromatograma de ejemplo de la separación de la lignina, componentes después de tioacidolisis y derivación TMS-se muestra. Claramente, la abundancia relativa de syringyl-(S), guayacil (G), y p-hidroxifenol-(H) unidades se puede determinar. El contenido de lignina soluble bromuro de acetilo se explica por sí mismo, se puede esperar que los valores de entre el 20-50% del peso seco de la pared. Hay que señalar que el bromuro de acetilo no solubilizar todos los presentes la lignina en la pared, y que el grado de solubilización puede variar dependiendo del material. Sin embargo, este método es relativamente fácil de realizar y rápido y da una excelente aproximación del contenido de lignina en un material lignocelulósico.

Figura 1:. Visión general del análisis lignocelulósicos paredes celulares (lignocelulosa) están aislados de material en bruto de plantas secas. El material de la pared se pondera en alícuotas y se divide para los ensayos de varios. Material de la pared se trata con bromuro de acetilo y la lignina solubilizada cuantificado por espectroscopia UV-. Para la determinación de la composición de la lignina, el material de la pared se somete a tioacidolisis. Los compuestos fenólicos solubilizados someterse a la derivación TMS y luego pueden ser separados y cuantificados por análisis GC-MS. La composición de polisacáridos de la matriz y el protocolo de celulosa cristalina contenido se discute en la Parte II ^2.

Figura 2:. Análisis exhaustivo lignocelulósicos de la madera de álamo, Astillas de madera de álamo (Populus tremoloides) fueron sometidos a los protocolos descritos.
Ligin composición; H p-hidroxifenil; G guayacil; S syringyl unidades.

Los métodos descritos permiten una rápida evaluación cuantitativa del contenido de lignina y la composición de la biomasa de plantas lignocelulósicas. El uso del robot iWall aproximadamente 350 muestras de suelo y puede ser dispensado por día. El rendimiento de los distintos métodos de análisis por persona varía. Utilizando los protocolos descritos aquí, 30 muestras se pueden procesar por el contenido de lignina, y 15 para la composición de la lignina por día. Debido a la naturaleza cuantitativa de los cultivos de materias primas de datos óptima, variedad o genotipos pueden ser evaluados en términos de su idoneidad para la producción de biocombustibles.

Estamos muy agradecidos a Mateo Robert Weatherhead de excelente servicio técnico y John Ralph, de la Universidad de Wisconsin, por sus valiosos consejos, discusiones, y la muestra de madera de álamo. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Energía de EE.UU. (DOE) de los Grandes Lagos del Centro de Investigación de Bioenergía (DOE BER Oficina de Ciencia-DE-FC02 07ER64494) y por las Ciencias Químicas, Geociencias y Ciencias Biológicas de la División de la Oficina de Ciencias Básicas de Energía, Oficina de Ciencia , EE.UU. Departamento de Energía (sin premio. DE-FG02-91ER20021).

1. Carroll, A., and Somerville, C. "Cellulosic Biofuels,". Annual Review of Plant Biology 60, 165 (2009).
2. Foster, C.E., Martin, T., Pauly, M. "Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates". Journal of Visualized Experiments (2010).
3. Fukushima, R. S., and Hatfield, R. D. "Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method,". J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133 (2001).
4. Pauly, M., and Keegstra, K. "Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels,". Plant J. 54(4), 559 (2008).
5. Robinson, A. R., and Mansfield, S. D. "Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling,". Plant J. 58(4), 706 (2009).
6. Somerville, C., et al., "Toward a systems approach to understanding plant-cell walls,". Science. 306 (5705), 2206 (2004).
7. Teeri, T. T., and Brumer, H. "Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases,". Biocatalysis and Biotransformation. 21 (4-5), 173 (2003).

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