Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

إعداد يسحق ذبابة الفاكهة كروموسوم كثور الخيوط الصبغية للجسم وصفها

, , , ,

Department of Biochemistry, Biophysics, and Molecular Biology, Iowa State University

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 23.20.196.179, User IP: 23.20.196.179, User IP Hex: 387237043

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: إعداد يسحق ذبابة الفاكهة كروموسوم كثور الخيوط الصبغية للجسم وصفها

Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling. J. Vis. Exp. (36), e1748, doi:10.3791/1748 (2010).

Abstract: إعداد يسحق ذبابة الفاكهة كروموسوم كثور الخيوط الصبغية للجسم وصفها

وقد تم منذ فترة طويلة ذبابة الفاكهة المفضلة لنظام نموذجي لدراسة العلاقة بين لونين وتنظيم بنية الجينات بسبب المزايا التي يقدمها الخلوي العملاقة اللعابية الكروموسومات كثور الخيوط الصبغية الغدة اليرقات طور مرحلي الثالثة. في هذا النسيج الكروموسومات الخضوع عدة جولات من تكرارها في حال عدم وجود انقسام الخلايا مما يؤدي إلى حوالي 1000 نسخة. الحمض النووي لا يزال الانحياز بعد كل دورة تنسخي مما أدى إلى تضخم كبير الكروموسومات التي توفر فرصة فريدة لربط مورفولوجيا لونين مع توطين للبروتينات محددة. وبالتالي ، كان هناك مستوى عال من الاهتمام في تحديد تعديلات جينية موجودة في جينات مختلفة وفي مراحل مختلفة من عملية النسخ. أداة مهمة لمثل هذه الدراسات هو وضع العلامات من الكروموسومات كثور الخيوط الصبغية مع الأجسام المضادة للانزيم ، وعامل النسخ ، أو تعديل هيستون في المصالح. هذا البروتوكول فيديو يوضح تقنية الاسكواش المستخدمة في المختبر يوهانسن لإعداد ذبابة الفاكهة الكروموسومات كثور الخيوط الصبغية لوصفها الأضداد.

Protocol: إعداد يسحق ذبابة الفاكهة كروموسوم كثور الخيوط الصبغية للجسم وصفها

ويتم تكييف بروتوكول التالية للإعداد للاسكواش كثور الخيوط الصبغية كروموسوم من الإجراء وصفها في يوهانسن وآخرون. (2009).

1. ثقافة يرقات ذبابة الفاكهة الثالث طور مرحلي

من أجل الحصول على الكروموسومات كثور الخيوط الصبغية الأمثل للاسكواش الاستعدادات العالية الجودة وشروط زراعة غير مزدحمة ضرورية (أي حوالي 20 مكان وضع البيض الذباب الإناث في مستوى 4 زجاجة الطيران "وتغيير قنينة جديدة كل يوم). حدد الأفراد بدانة من أول محصول من التسلق 3 طور مرحلي اليرقات في حين أنها لا تزال تتخبط ولكن فقط قبل pupation نحن الثقافة بشكل روتيني في 21 درجة مئوية ولكن 18 درجة مئوية وسوف تسفر بدانة الكروموزومات التي قد تكون أكثر ملاءمة لبعض الأغراض مثل على سبيل المثال عندما الفرقة / إنتربيرد مناطق تحتاج إلى تصور بدقة عالية.

2. مواد الاسكواش كثور الخيوط الصبغية

  • ملقط تشريح دروموند (2)
  • أطباق بتري (60 × 15 ملم)
  • شرائح مجهرية بلوري (رقم فيشر 12-544-3) (بولي يسين المغلفة)
  • 22 × 22 مم تغطية زلات رقم 15 (فيشر رقم 12 - 520B) (مغلفة Sigmacote ؛ سيغما # SL2)
  • رقم 22 × 40 ملم زلات تغطية 15 (فيشر رقم 12 - 530B)
  • كيم مناديل
  • المرحلة المجهر يتناقض مع الهدف 20X
  • ديوار الصغيرة (على سبيل المثال ، وقارورة فراغ أو زجاجة الترمس)
  • ملقط طويل
  • شفرات حلاقة
  • Coplin جرة
  • خادمة المطاط أو علبة تثبرور (أو علبة اغلاقها باحكام ما يعادلها)
  • Parafilm (مقطعة إلى مربعات 22 ملم)
  • أوزان 175 غرام

3. مثبتات والحلول

  1. 5X الأسهم الفورمالديهايد. يعد حلا جديدة من 0.74 غرام. بارافورمالدهيد في مل من 4.0 درهم و 2 O مع 28 ميكرولتر من KOH 1N. الحارة إلى 65 درجة مئوية إلى حل بارافورمالدهيد وتخزينها ثم على الجليد.
  2. تثبيتي 1. يعد حلا جديدة من برنامج تلفزيوني 0.5 مل 10X ، 50μl تريتون X - 100 ، 3.45 مل درهم 2 O و 1.0 مل من الأسهم الفورمالديهايد 5X. الحارة لتفريق تريتون X - 100 واستخدامها في حدود 1 ساعة.
  3. تثبيتي 2. يعد حلا جديدة من 1.5 مل O 2 درهم ، 2.5 مل حمض الخليك الجليدية ، و 1.0 مل من المخزون واستخدام الفورمالدهايد 5X في حدود 1 ساعة.
  4. Lactoacetic حامض الحل. إعداد محلول حامض اللبنيك 1 مل ، 2 مل 2 O درهم ، و 3 مل حامض الخليك.

4. كثور الخيوط الصبغية إعداد كروموسوم الاسكواش :

  1. شطف اليرقات بالماء ونقل لبرنامج تلفزيوني في نسيج الثقافة طبق لتشريح.
  2. فهم غيض من الفم السنانير مع زوج واحد من الملقط ، عقد الجسم حوالي 2 / 3 من الطريق نزولا مع الزوج الآخر ، وسحب السنانير على الفم بحيث تتعرض الغدد اللعابية. فصل الغدد اللعابية من الدماغ والعين antennal أقراص ، وبعيدا عن تشريح الجسم من الدهون والأنسجة الأخرى المرتبطة بها أي من الغدد.
  3. إضافة 200 microliters من 1 إلى تثبيتي أول بئر للشريحة two الاكتئاب جيدا و200-300 microliters من 2 مثبت لاثنين ايضا. نقل زوج واحد من الغدد اللعابية في وقت لتثبيتي 1 في بئر واحدة لاحتضان مقدار الوقت اللازم لحاتمة الهدف ، وعادة حوالي 1-2 دقائق. (ملاحظة : بعض الحواتم ، مثل معظم تعديلات بسيطة ، قد تحتاج إلى 5 دقائق أو أطول التثبيت).
  4. ملقط به نقل الغدد اللعابية إلى 2 في 2 مثبت جيدا واحتضان لمدة دقيقتين.
  5. نقل إلى الغدد 10-30 ميكرولتر من محلول حمض Lactoacetic على ساترة a Sigmacoted نظيفة. انخفاض بلطف شريحة مجهر متعدد الليزين المغلفة على وساترة ، وبدون الضغط العمودي ، التقط ساترة حتى الغدد ما بين الشريحة وساترة ل. تيسير فورا تحلل الخلايا والكروموسومات التي تنتشر استيعاب بعناية ساترة مع ملقط على حافة واحدة وتتحرك بلطف مرة أخرى بشكل طفيف وإيابا ، في محاولة للحد من أي ضغط عمودي على الأنسجة. بدلا من استخدام الجانب ممحاة قلم رصاص أو حتى الإصبع لتحريك بلطف ساترة ذهابا وإيابا. علما بأن أي تأخير في نقل ساترة ذهابا وإيابا من المرجح أن يتضاءل انتشار الأسلحة الكروموسومات لأنها سوف تميل الى ان تصبح أكثر جمودا عند التعرض لمحلول حمض Lactoacetic. تغيم الحل هو غالبا ما يكون مؤشرا جيدا لفصل الخلايا. التنصت بلطف ساترة بشكل غير مباشر (لتجنب الضغط العمودي) مع الجانب ممحاة قلم رصاص في أوقات قليلة قد تساعد أيضا في نشر الكروموسومات.
  6. فحص الأنسجة على الفور تحت المجهر مرحلة يتناقض مع هدف 40X 20 أو لتحديد ما إذا كانت الصبغيات بشكل جيد الانتشار.
  7. عندما نشر الكروموسومات يكون كافيا وتعيين الشريحة مع الجانب ساترة الخناق على كومة من مناديل وكيم نظيفة. المركز الثاني على رأس كيم يمسح وتتسطح الكروموسومات عن طريق وضع الإبهام على حيث يتم وضع ساترة وضغط بشدة ، وتجنب أي تحرك الأفقي للساترة أن القصالكروموسومات.
  8. فحص الشريحة مرة أخرى تحت المجهر لتحديد ما إذا كان إعداد مناسبة لهذا الغرض المقصود. إذا تحركت بشكل ملحوظ الكروموسومات على سحق ، واستخدام أقل حجم من محلول حمض Lactoacetic الخاص في الأعمال التحضيرية اللاحقة. كرر الخطوات من 4،1-4،8 حتى تم الحصول على عدد كاف من الشرائح مناسبة. مكان أوزان 175 غرام على ساترة من الشرائح.
  9. ملء ديوار صغيرة (مثل زجاجة الترمس) مع النيتروجين السائل. باستخدام الملقط طويلة ، وتراجع الانزلاق الى السائل N 2 حتى توقف عن الغليان ، وإزالة الشريحة ، واستخدامها مباشرة على حافة شفرة حلاقة نظيفة في زاوية واحدة على الوجه قبالة ساترة. إذا كان سيتم استخدام الشريحة على الفور ، ومكان في جرة Coplin مع برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. بخلاف ذلك جمع الشريحة في جرة مليئة Coplin الايثانول 95 ٪. دراسة ساترة مرة واحدة في الصقيع ومصعد بعيدا للتأكيد على أن الأنسجة انضمت إلى الشريحة ، ولم يبقى مع ساترة. أكرر مع بقية الشرائح حتى يتم تخزين كافة الشرائح في أي برنامج تلفزيوني (للاستخدام في غضون عدة ساعات) أو الإيثانول (للتخزين على المدى الطويل).

ممثل النتائج

الخطوة الأولى الحاسمة للحصول على ارتفاع الاسكواش كثور الخيوط الصبغية إعداد الجودة هي أن تنمو اليرقات الدهون مع كبير نوى الغدة اللعابية. والثاني هو أسلوب جيد للإجراءات نشر ، والذي قد يستغرق بعض الممارسات. طرف واحد لتحسين نجاح نشر هو العثور على كمية ضئيلة من محلول حمض lactoacetic خلال سحق الخطوة. وهذا يكفي تعزيز انتشار الصبغيات دون توليد القوى المفرطة التي يمكن أن تدفق الأسلحة غسل كروموسوم بعيدا. ومن الجدير بالذكر أيضا أن أي تأخير في نقل ساترة ذهابا وإيابا سوف يقلل انتشار الأسلحة الكروموسومات لأنها تصبح أكثر جمودا عند تعرضها للحمض Lactoacetic الحل.

إذا كان كل شيء على ما يرام ، يجب أن يكون هناك العديد من الكروموسومات كثور الخيوط الصبغية انتشار جيدا. ويظهر الشكل 1 مثالا على إعداد مثل هذا المسمى مع علامة ضعف للمناطق الخضراء في إنتربيرد مع وجود بقع الصبغة التي تجمعت في المناطق الزرقاء. إذا تم الحصول على نشر غير كافية ، فإن الصبغيات تبدو وكأنها كرات صغيرة ، كما هو مبين في الشكل 2. من ناحية أخرى ، إذا كان الكثير من الانتشار قد حدث ، فإن chomosomes تكون رقيقة جدا وطويلة أو في بعض الحالات مجزأة الى قطع صغيرة كما هو مبين في الشكل 3.

الشكل 1
الرقم الاسكواش كثور الخيوط الصبغية 1. إعداد المسمى مزدوجة مع الأجسام المضادة للكيناز H3S10 الشبكة الاسلامية الليبرالية هيستون - 1 (باللون الأحمر) وهويشت (الأزرق).

الشكل 2
كثور الخيوط الصبغية الاسكواش الرقم 2. مع انتشار غير كافية.

الشكل 3
الشكل 3. الاسكواش كثور الخيوط الصبغية مع الكثير من الانتشار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: إعداد يسحق ذبابة الفاكهة كروموسوم كثور الخيوط الصبغية للجسم وصفها

إدراج الأحماض الخل واللبن في البروتوكولات التقليدية التثبيت الاسكواش يسهل على حد سواء ، والقرار إنتربيرد الذراع الكروموسومات نشر ولكن للأسف بعض الحواتم لا ينجو من هذا العلاج. مثال على مثل هذا هو حاتمة H3S10ph (تساى وآخرون ، 2008). منذ حامض العلاج أيضا لديه عيب أن يروي مضان المتأصلة في GFP الموسومة البروتينات ، DiMario وآخرون. (2006) وضعت مؤخرا الفورمالديهايد المستندة إلى تقنية "الاسكواش الخالية من المواد الحمضية" التي تسمح لرؤية مباشرة من البروتين GFP الانصهار في الكروموسومات كثور الخيوط الصبغية GFP الضد دون وضع العلامات وكذلك للكشف عن الأجسام المضادة لحمض حساسة الحواتم. موصوفة مزيد من التعديلات لهذا الإجراء بالتفصيل في يوهانسن وآخرون. (2009). ويرد حمض الثابتة ممثل إعداد الاسكواش كثور الخيوط الصبغية المسمى مزدوجة مع الأجسام المضادة للكيناز H3S10 الشبكة الاسلامية الليبرالية - 1 هيستون وهويشت في الشكل. 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: إعداد يسحق ذبابة الفاكهة كروموسوم كثور الخيوط الصبغية للجسم وصفها

Acknowledgements: إعداد يسحق ذبابة الفاكهة كروموسوم كثور الخيوط الصبغية للجسم وصفها

نشكر السيدة ف Lephart لصيانة المخزونات يطير وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الصحية للحصول على منحة (GM62916) والمؤسسة الوطنية للعلوم منح (MCB0817107).

References: إعداد يسحق ذبابة الفاكهة كروموسوم كثور الخيوط الصبغية للجسم وصفها

  1. Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J. & Johansen, K.M. RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila. Development 135, 2917-2925, (2008).
  2. DiMario, P., Rosby, R., & Cui, Z. Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes. Dros. Inf. Serv. 89, 115-118, (2006).
  3. Johansen, K.M., Cai, W., Deng, H., Bao, X, Zhang, W., Girton, J. & Johansen, J. Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies. Methods 48, 387-397, (2009).

Ask the Author: إعداد يسحق ذبابة الفاكهة كروموسوم كثور الخيوط الصبغية للجسم وصفها

4 Comments

can please know how you made the fix 1 and 2
can you please send me the protocal

1

Reply

Posted by: monaApril 21, 2010, 4:46 AM


Fixative 1. mix 50 ul 10X PBS, 5μl Triton X-100, 345 ul dH2O and 100 ul of 5X formaldehyde stock. Warm to disperse the Triton X-100.
Fixative 2. mix 150ul dH2O, 250 ul Glacial Acetic Acid, and 100 ul of 5X formaldehyde stock.
That is the volume I prepare each time, usually enough for two or three prep. You need to prepare 5X formaldehyde stock first and this stock you can keep in -20C for a long time. However the Fix1 and Fix2 you need to prepare freshly. If you have any question you can send me another e-mail. Thanks!

1.1

Reply

Posted by: AnonymousApril 22, 2010, 1:11 PM

This may be a dumb question but when you put the tissue in Fixative 1 the Triton will lyse the membrane(s), correct? What keeps you from losing the chromosomes in either Fixative 1 and/or Fixative 2? Is it the PFA? The reason I ask is because I have followed your protocol and I see ALOT of tissue that resemble lysed cells (i.e. rounded edges with "tear" spots at various locations); however, I obtain very few polytene chromosomes? My thought is that they may be getting flushed out during my transfers. Do you have any advice? Thanks!

Jared

2

Reply

Posted by: JaredDecember 6, 2011, 4:29 PM

You are right about the Triton. If you leave the glands in too long they will fall apart. The trick is to leave them in just long enough. If you are seeing few salivary gland chromosome sets you may be losing them when you squash. When you put them on the coverslip and then pick up the coverslip with the slide the chromosomes may float away to the edges of the cover slip if there is too much liquid present. Try placing them on the coverslip in a smaller drop of liquid and being careful about how you apply the pressure when you squash. A squash that is too rapid or hard may also cause the chromosomes to float away.

2.1

Reply

Posted by: Jack GirtonDecember 7, 2011, 12:53 PM

The dissection forceps we use were mis-identified: they should be Dumont Style #5/Biology.

3

Reply

Posted by: Kristen J.September 13, 2012, 4:30 PM

useful material thank you

4

Reply

Posted by: naglaa e.May 12, 2013, 5:57 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter