Preparación de los cromosomas politénicos de Drosophila Calabazas para el Etiquetado de anticuerpos

El siguiente protocolo para la preparación de la calabaza politénicos cromosoma es una adaptación del procedimiento descrito en Johansen et al. (2009).

1. Cultura de tercer estadio las larvas de Drosophila

Con el fin de obtener óptimos cromosomas politénicos de alta calidad de las preparaciones squash, las condiciones de cultivo con poca gente son esenciales (es decir, el lugar alrededor de 20 huevos moscas hembra en un estándar de 4 botellas vuelan "y el cambio de una botella nueva cada día). Elija el más gordo de los individuos de la primera cosecha de la escalada tercera larvas mientras que todavía están vagando, pero justo antes de la pupación. De manera rutinaria la cultura a 21 ° C, pero 18 ° C se producen mayores cromosomas que pueden ser más adecuados para ciertos fines, como por ejemplo, cuando la banda / regiones interbandas necesidad de ser visualizadas en alta resolución.

2. Materiales politénicos de squash

• Drummond pinzas de disección (2)
• Placas de Petri (60 x 15 mm)
• Frosted portaobjetos de microscopio (Fisher N º 12-544-3) (poli-lisina)
• 22 x 22 mm N º 15 cubreobjetos (Fisher No. 12-520B) (recubierto con Sigmacote; Sigma # SL2)
• 22 x 40 mm N º 15 cubreobjetos (Fisher No. 12-530B)
• Kim-toallitas
• Microscopio de contraste de fase con el objetivo de 20X
• Dewar pequeña (por ejemplo, termo o botella termo)
• Unas pinzas largas
• Hojas de afeitar
• Coplin Jar
• De goma-Maid o en la bandeja de Tupperware (o la bandeja de cierre hermético equivalente)
• Parafilm (cortadas en cuadrados de 22 mm)
• 175 g de peso

3. Fijadores y soluciones

1. Acciones de formaldehído 5X. Prepare una solución fresca de 0,74 g. paraformaldehído en 4,0 ml de dH ₂ O y con 28 l de KOH 1N. Calentar a 65 ° C para disolver el paraformaldehído y luego almacenar en hielo.
2. Fijador 1. Prepare una solución fresca de 0,5 ml de PBS 10X, 50μl Triton X-100, 3,45 ml dH ₂ O y 1,0 ml de una reserva de formaldehído 5X. Caliente para dispersar a la Triton X-100 y su uso dentro de una hora.
3. Fijador 2. Prepare una solución fresca de 1,5 ml de dH ₂ O, 2,5 ml de ácido acético glacial, y 1,0 ml de una reserva de formaldehído 5X y su uso dentro de una hora.
4. Solución de ácido Lactoacetic. Prepare una solución de ácido láctico de 1 ml, 2 ml de dH ₂ O, y 3 ml de ácido acético.

4. Cromosomas politénicos de squash preparación:

1. Enjuague con agua las larvas y la transferencia de PBS en una placa de cultivo de tejidos para la disección.
2. Agarre la punta de la boca ganchos con un par de pinzas, sujete el cuerpo aproximadamente 2 / 3 del camino hacia abajo con la otra pareja, y tirar de la boca ganchos para las glándulas salivales están expuestos. Separar las glándulas salivales del cerebro y los ojos-antenal discos, y diseccionar la grasa corporal y los tejidos asociados a otros de las glándulas.
3. Añadir 200 microlitros de un fijador para el primer pozo de una diapositiva de la depresión y dos y 200 a 300 microlitros de fijador y 2 a dos. La transferencia de un par de glándulas salivales en un momento en que un fijador en un bien e incubar la cantidad de tiempo requerido para el epítopo objetivo, por lo general unos 1-2 minutos. (Nota: algunos epítopos, como la mayoría de las modificaciones de las histonas, puede requerir 5 minutos o más la fijación.)
4. Pinzas mediante la transferencia de las glándulas salivales de fijador y 2 en 2 y se incuba durante dos minutos.
5. Transferencia de las glándulas de 10-30 l de solución de ácido Lactoacetic en un cubreobjetos Sigmacoted limpio. Baje suavemente el portaobjetos del microscopio recubiertos con polilisina sobre el cubreobjetos y, sin aplicar presión vertical, levante el cubreobjetos para las glándulas se encuentran entre el portaobjetos y un cubreobjetos el. Inmediatamente facilitar la lisis celular y la difusión de los cromosomas con cuidado agarrando el cubreobjetos con unas pinzas en un borde y suavemente mueve un poco hacia atrás y hacia delante, tratando de minimizar cualquier presión vertical sobre el tejido. También puedes utilizar el lado de goma de un lápiz o un dedo para mover suavemente el cubreobjetos de ida y vuelta. Tenga en cuenta que cualquier retraso en el movimiento de la cubreobjetos de ida y vuelta es probable que disminuya la difusión de los brazos cromosómicos ya que tienden a ser más rígidos con la exposición a la solución de ácido Lactoacetic. Enturbiamiento de la solución es a menudo una buena indicación de la separación de células. Golpeando suavemente el cubreobjetos oblicua (para evitar la presión vertical) con la cara de goma de un lápiz un par de veces también puede ayudar en la difusión de los cromosomas.
6. Inmediatamente examinar el tejido bajo un microscopio de contraste de fase con un objetivo de 20 o 40 veces para determinar si los cromosomas están bien extendidas.
7. Cuando la difusión de los cromosomas es suficiente, establezca la diapositiva con la parte cubreobjetos abajo en una pila de agua limpia Kim-toallitas. Coloque un segundo Kim-borrar en la parte superior y aplanar los cromosomas, colocando el pulgar sobre el lugar donde se coloca el cubreobjetos y presionar con firmeza, evitando cualquier movimiento horizontal del cubreobjetos que se cortelos cromosomas.
8. Examinar el portaobjetos de nuevo bajo el microscopio para determinar si la preparación es adecuada para el propósito previsto. Si los cromosomas se han movido de manera significativa a aplastar, usar menos volumen de solución ácida Lactoacetic en su preparación posterior. Repita los pasos 4.1-4.8 hasta un número suficiente de diapositivas adecuadas se han obtenido. Lugar 175 pesos g en el cubreobjetos de las diapositivas.
9. Llenar un pequeño Dewar (por ejemplo, termo) con nitrógeno líquido. Con una pinza larga, baño caer en N ₂ líquido hasta que deje de hervir, retire de diapositivas, e inmediatamente utilizar el borde de una hoja de afeitar limpia en una esquina para voltear de la cubreobjetos. Si de diapositivas se puede utilizar de inmediato, colocar en un frasco Coplin con PBS a 4 ° C. Cualquier forma de recolectar la diapositiva en una jarra Coplin llena de etanol al 95%. Examinar el portaobjetos una vez que el hielo se ha sublimado lejos de confirmar que el tejido adherido a la diapositiva y no quedarse con el cubreobjetos. Repita con el resto de las diapositivas hasta que todas las diapositivas se almacenan en PBS (para su uso dentro de varias horas) o etanol (para un almacenamiento más largo plazo).

Resultados representante

El primer paso crítico para la obtención de politénicos de alta calidad de la preparación de squash es hacer crecer las larvas de grasa con núcleos grandes glándulas salivales. El segundo es una buena técnica con el procedimiento de difusión, que puede tomar un poco de práctica. Un consejo para el éxito de la mejora se está extendiendo para encontrar el volumen mínimo de solución de ácido lactoacetic durante el paso de aplastamiento. Esto promoverá la suficiente difusión de los cromosomas sin generar excesivas fuerzas de transmisión que puede lavarse los brazos cromosómicos de distancia. Es también digno de mención que cualquier retraso en el movimiento de la cubreobjetos de ida y vuelta se reducirá la difusión de los brazos cromosómicos, ya que se vuelven más rígidos cuando son expuestos a la solución de ácido Lactoacetic.

Si todo va bien, debería haber numerosas y difundir los cromosomas politénicos. La figura 1 muestra un ejemplo de este tipo de preparación, el doble etiquetado con un marcador para las regiones interbandas en verde y con un colorante que tiñe las regiones con bandas de color azul. Si es insuficiente la difusión se obtiene, los cromosomas se verá como bolitas, como se muestra en la Figura 2. Por otro lado, si mucho la difusión que ha ocurrido, el chomosomes será demasiado delgada y se extendió en algunos casos, fragmentado en pedazos pequeños, como se muestra en la Figura 3.

Figura 1. Preparación de calabaza politénicos doble etiquetado con anticuerpos contra el JIL-1 histona H3S10 quinasa (en rojo) y Hoechst (azul).

Figura 2. Politénicos calabaza con la difusión suficiente.

Figura 3. Calabaza politénicos con demasiada difusión.

La inclusión de los ácidos acético y láctico en los protocolos convencionales de squash fijación facilita tanto la resolución interbandas y brazo cromosómico de propagación, pero, lamentablemente, algunos epítopos no sobreviven a este tratamiento. Un ejemplo de este tipo es un epítopo H3S10ph (Cai et al., 2008). Dado que el tratamiento con ácido también tiene la desventaja de que apaga la fluorescencia intrínseca de las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas, DiMario et al. (2006) ha desarrollado recientemente una base de formaldehído "libre de ácido técnica de squash" que permiten la visualización directa de la proteína GFP-fusión en los cromosomas politénicos sin etiquetado GFP-anticuerpo, así como para la detección de anticuerpos de epítopos sensibles a los ácidos. Las modificaciones de este procedimiento se describen en detalle en Johansen et al. (2009). Un ácido representativo fijado preparación de squash politénicos doble etiquetado con anticuerpos contra el JIL-1 histona quinasa H3S10 y Hoechst se muestra en la figura. 1.