Preparação de Abóboras Drosophila cromossomos politênicos para Rotulagem de anticorpos

O seguinte protocolo para a preparação politênicos cromossomo de squash é uma adaptação do procedimento descrito no Johansen et al. (2009).

1. Cultura de larvas de terceiro instar Drosophila

A fim de obter melhor cromossomos politênicos para preparações de squash de alta qualidade, condições de cultivo uncrowded são essenciais (ou seja, coloque em torno de 20 egg-laying moscas fêmeas em um padrão de garrafa fly 4 "e mudar para um novo frasco a cada dia). Selecione o mais gordo indivíduos a partir da primeira safra de escalada larvas 3 enquanto eles ainda estão vagando, mas pouco antes de pupação. Nós cultura rotineiramente a 21 ° C 18 ° C, mas vai render mais gordos que os cromossomos podem ser mais adequados para determinados fins, como por exemplo quando a banda / interband regiões precisam ser visualizados em alta resolução.

2. Politênicos materiais de squash

• Pinça de dissecção Drummond (2)
• Placas de Petri (60 x 15 mm)
• Lâminas de microscopia fosco (n º 12-544-3 Fisher) (poli-lisina-revestido)
• 22 x 22 mm N º 15 lamínulas (Fisher No. 12-520B) (revestido com Sigmacote; Sigma # SL2)
• 22 x 40 No. 15 mm lamínulas (Fisher No. 12-530B)
• Kim-wipes
• Microscópio de contraste de fase com objetivo 20X
• Pequena Dewar (por exemplo, balão de vácuo ou garrafa térmica garrafa)
• Forceps longo
• Giletes
• Coplin Jar
• Maid de borracha ou bandeja de Tupperware (ou bandeja selável equivalente)
• Parafilme (corte em 22 quadrados mm)
• 175 pesos g

3. Fixadores e soluções

1. Estoque de formaldeído 5X. Prepare uma nova solução de 0,74 g. paraformaldeído em 4,0 ml de dH ₂ O e com 28 mL de KOH 1N. Quente a 65 ° C para dissolver o paraformaldeído e depois armazenar no gelo.
2. Fixador 1. Prepare uma nova solução de 0,5 ml de PBS 10X, 50μl Triton X-100, 3,45 ml dH ₂ O e 1,0 ml de um estoque de formaldeído 5X. Quente para dispersar o Triton X-100 e usar dentro de 1 hora.
3. Fixador 2. Prepare uma nova solução de 1,5 ml dH ₂ O, 2,5 ml de ácido acético glacial, e 1,0 ml de um estoque de formaldeído 5X e usar dentro de 1 hora.
4. Solução de ácido Lactoacetic. Prepare uma solução de 1 ml de ácido lático, 2 ml dH ₂ O, e 3 ml de ácido acético.

4. Politênicos preparação de squash cromossomo:

1. Enxágüe com água e larvas de transferência para PBS em um prato de cultura de tecidos para dissecção.
2. Segure a ponta da boca ganchos com um par de pinças, segurar o corpo cerca de 2 / 3 do caminho para baixo com o outro par, e puxar a boca ganchos para as glândulas salivares são expostas. Separe as glândulas salivares do cérebro e olho-antenais discos, e dissecar afastado a gordura corporal e quaisquer outros tecidos associados das glândulas.
3. Adicione 200 microlitros de Fixação 1 para o primeiro poço de uma lâmina de depressão duas bem e 200-300 microlitros de 2 de Fixação para o bem dois. Transferência de um par de glândulas salivares em um momento de um fixador em um bem e incubar para a quantidade de tempo necessário para o epítopo alvo, geralmente cerca de 1-2 minutos. (Nota: alguns epítopos, como para a maioria das modificações das histonas, pode exigir 5 minutos ou mais fixação.)
4. Forceps utilizando transferência de as glândulas salivares a 2 de Fixação em dois bem e incubar por dois minutos.
5. Transferência das glândulas para 10-30 ml de solução de ácido Lactoacetic em uma lamela limpa Sigmacoted. Suavemente inferior uma lâmina de microscópio polilisina revestido para a lamela e, sem aplicar pressão vertical, pegar a lamela para as glândulas são entre a lâmina ea lamela. Imediatamente facilitar a lise celular e cromossômica espalhando com cuidado segurando a lamela com uma pinça em uma extremidade e suavemente movendo-a ligeiramente para trás e para frente, tentando minimizar qualquer pressão vertical sobre o tecido. Como alternativa, use o lado da borracha de um lápis ou até mesmo um dedo para mover suavemente a lamínula e para trás. Note que qualquer atraso no movimento a lamela trás e para frente tende a diminuir se espalhando dos braços cromossômicos como eles tendem a tornar-se mais rígida em cima da exposição à solução de ácido Lactoacetic. Turvação da solução é muitas vezes uma boa indicação de separação de células. Batendo a lamela obliquamente (para evitar a pressão vertical) com o lado da borracha de um lápis, algumas vezes também pode ajudar na divulgação cromossômicas.
6. Examinar imediatamente o tecido ao microscópio de contraste de fase com um objectivo de 20 ou 40X para determinar se os cromossomos são bem distribuídos.
7. Quando o cromossômicas espalhando é suficiente, configure o slide com o lado da lamínula para baixo em uma pilha de limpeza Kim-wipes. Coloque um segundo Kim-limpe em cima e alise cromossomos, colocando o polegar sobre onde as lamelas é posicionado e pressionando firmemente, evitando qualquer movimento horizontal da lamela que cisalhamentoos cromossomos.
8. Examine o slide novamente sob o microscópio para determinar se a preparação é adequada para a finalidade pretendida. Se os cromossomos se mudaram significativamente após esmagamento, use menos volume de solução de ácido Lactoacetic em suas preparações subseqüentes. Repita os passos 4,1-4,8 até que um número suficiente de slides adequados foram obtidos. Coloque 175 g pesos sobre as lamelas das lâminas.
9. Preencher um pequeno Dewar (por exemplo, garrafa térmica) com nitrogênio líquido. Usando uma pinça longa, mergulhe em líquido deslize N ₂ até o pára ferver, retire slide, e imediatamente usar a borda de uma lâmina de barbear limpa em um canto para virar fora da lamela. Se deslize será usado imediatamente, colocar em uma jarra Coplin com PBS a 4 ° C. De outra forma coletar o slide em uma jarra Coplin cheia de etanol a 95%. Examine a lamela uma vez que a geada tenha sublimado longe para confirmar que o tecido aderido ao slide e não permanecer com a lamela. Repita com o restante dos slides até que todos os slides são armazenados em um PBS (para uso dentro de algumas horas) ou etanol (para armazenamento a longo prazo).

Resultados representante

O primeiro passo crítico para a obtenção de alta qualidade, preparação de squash politênicos é crescer larvas de gordura com núcleos das glândulas salivares grande. A segunda é uma boa técnica com o procedimento se espalhando, o que pode levar um pouco de prática. Uma dica para o sucesso espalhar melhor é encontrar o volume mínimo de solução de ácido lactoacetic durante a etapa de esmagamento. Isto irá promover a divulgação suficiente dos cromossomos sem gerar excesso de forças de fluxo que pode lavar os braços do cromossomo distância. Também é importante notar que qualquer atraso no movimento a lamela frente e para trás irá reduzir espalhando dos braços cromossômicos como eles se tornam mais rígida quando exposta à solução de ácido Lactoacetic.

Se tudo correr bem, deve haver numerosos bem distribuídos cromossomos politênicos. A Figura 1 mostra um exemplo de uma tal preparação, duplamente marcada com um marcador para regiões interband em verde e com um corante que as manchas nas regiões em faixas em azul. Se espalhando insuficiente é obtido, os cromossomos se parecerá com pequenas bolas, como mostrado na Figura 2. Por outro lado, se espalhando muito ocorreu, o chomosomes vai ser muito fino e prolongado ou em alguns casos, fragmentado em pequenos pedaços, como mostrado na Figura 3.

Figura 1. Preparação de squash politênicos duplamente marcada com o anticorpo para o JIL-1 histona H3S10 quinase (em vermelho) e Hoechst (azul).

Figura 2. Politênicos de squash com espalhando insuficiente.

Figura 3. Politênicos de squash com muita divulgação.

A inclusão de ácido acético e láctico em protocolos convencionais de fixação de squash facilita tanto a resolução interband e braço cromossômico de propagação mas infelizmente alguns epítopos não sobrevivem este tratamento. Um exemplo de tal é um epítopo H3S10ph (Cai et al., 2008). Uma vez que o tratamento com ácido também tem a desvantagem de que sacia a fluorescência inerente de proteínas GFP, DiMario et al. (2006) desenvolveu recentemente um formaldeído-based "técnica de squash acid-free" que permitem a visualização direta do GFP-fusão de proteínas nos cromossomos politênicos sem GFP-anticorpo rotulagem, bem como para detecção de anticorpos de ácido-sensíveis epitopos. As modificações para este procedimento estão descritos em detalhes no Johansen et al. (2009). Um representante de ácido preparação de squash fixo politênicos duplamente marcada com o anticorpo para o JIL-1 histona H3S10 quinase e Hoechst é mostrado na figura. 1.