Çözünür Sinyal aracılı Etkileşimleri Araştırılması için Epitel Hücreleri ve Bakteriler mikroakışkan Co-kültür

1. Standart SU-8 fotolitografi ¹ (Bu video görünmez) kullanılarak silikon ustaların Fabrikasyon.

1. SU-8 "efendileri" (SÜ-8 2050, MicroChem, Newton, MA) bir temiz oda farklı bileşenleri (farklı kalınlıktaki PDMS membranlar, ko-kültür odası) imalatı için. Oluşturmak için standart SU-8 fotolitografi yöntemleri kullanın. Böyle bir ana kalıp herhangi bir mikroimalat tesisi (örneğin, Stanford Mikroakiskan Döküm http://thebigone.stanford.edu/foundry/ imal edilebilir) .
2. PDMS çoğaltma önce ana PDMS kolay bırakma kolaylaştırmak için bir vakum kaynağına bağlı bir desikatöre fluorosilane buharı SU-8 ustaları maruz bir kağıt havlu fluorosilane bir damla ekleyin ve bir dakika süreyle vakum uygulamak. Vakum çıkarın ve fluorosilane birikimi için 30 dakika izin verin. SU-8 ana ileride kullanmak üzere kapalı bir kapta tutun.

2. SU-8 master ² PDMS Replica kalıplama

1. Akışkan katman ve kontrol katmanı SU-8 ustadan PDMS çoğaltma kalıplama yapılır.
2. 10:01 ağırlıkça PDMS pre-polimer ve çapraz bağlayıcı karıştırın. 1 saat (ya da hava kabarcıkları PDMS karışımından kaldırılana kadar) için bir desikatöre oranı ve gazını.
3. Petri SU-8 ana yerleştirin ve dikkatle SU-8 ustanın üstüne PDMS karışımı dökün. Tekrar Degas PDMS.
4. Spin kalıp kalıp etrafında 100μm yeknesak bir PDMS kalınlığı elde etmek için bir dakika için 1200 rpm.
5. PDMS tedavi için bir saat PDMS ve 80 SU-8 ana kalıp ° C içeren petri ısıtın.
6. Kaldır tedavi PDMS kaplı ocak SU-8 ana.
7. SU-8 master PDMS kalıp soyun.
8. Iki bakteri girişler, bir çıkış ve bir pnömatik bağlantı noktası için 20 gauge künt uç iğne kullanarak PDMS kalıp dört delik delin.

3. Çok katmanlı PDMS cihazları Bağlar: Bu cihaz üç katmandan ana kanal, orta pnömatik tabakası, ve bakteriler için kanalları içeren bir alt bakteriyel katman içeren bir üst tabaka ile monte edilir. Üç kat aşağıda açıklandığı şekilde monte edilir.

1. Metanol ile PDMS membranlar ıslak ve temiz bir forseps kullanarak SU-8 ana kalıp dikkatle onları soymak. Bir teflon levha üzerine yerleştirin membran.
2. Bir oksijen plazma odası pnömatik membran ve akışkan katman yerleştirin. 40 sn (oksijen basıncı 10 sccm, RF güç 100W) için plazma açın.
3. Plazma maruz kaldıktan sonra, 10 dakika içinde alt PDMS kanal membran forseps kullanarak hizalayın. Membran ve PDMS katmanları ekleme metanol katmanları serbest dolaşımına yardımcı olur ve hizalamayı kolaylaştırır. Bu durumda, cihaz, metanol buharlar kaçmasına izin için bir gazlı bez parçası üzerinde yer almaktadır.
4. 8 saat 80 ° C'de ocak Cure hizalı PDMS katmanları
5. Bağ üst kanal birleştirilmiş kompozit PDMS aygıtına 3.4 - pnömatik membran alt tabakası üzerine yapıştırma sonra, adımları 3.2 tekrarlayın.

4. PDMS cihaz ^3,4 birleştirmek

1. Ökaryotik hücre ve bakteri ekim için kullanılan giriş ve çıkış delikleri delikler delin.
2. Limanlarına Tygon boru (0,01 inç OD) bağlayın ve 20ml bir şırınga ile çekerek pnömatik katmanı işletmek.
3. PDMS model ve bir oksijen plazma odasına önceden temizlenmiş cam slayt yerleştirin. Plazma açın vakum uygulamadan 20 sn (oksijen basıncı 20 sccm, RF güç 300W).
4. Adanın duvar cam slayt (PDMS) yapıştırma arasındaki temasını önlemek için, hemen bir şırınga cihaza bağlayın ve şırınga çekerek ve bir yerde tutarak vakum uygulamak.
5. Camına PDMS modeli (2 dakika içinde) yavaşça basın.
6. Cure PDMS cihazı 80 ° C'de 10 dakika.

5. Fibronektin ile cam yüzey Tedavisi

1. UV altında 15 dakika Tygon boru her bağlantı noktasına bağladıktan sonra cihaz sterilize edin.
2. Dolgu ve kanal kanal herhangi bir enkaz kaldırmak için steril PBS akışı. Hava kabarcıklarını çıkarmak için, 10 dakika boyunca akışı uygulayın. Hava kabarcıkları gaz geçirgenliği sayesinde kolayca PDMS kaçabilir.
3. Pnömatik kanal kanal içinde hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için içine bir renk boya çözüm doldurun.
4. Fibronektin 1 mcg / ml cam ökaryotik hücre tohumlama kolaylaştırmak için, cihazın içine tanıtmak ve 37 en az 40 dakika boyunca inkübe ° C
5. 1 ml büyüme medya ile aşırı fibronektin yıkayın.

6. Ortakçı E. Oluşumu ve ölçüm coli biyofilm INadalar

1. OD ₆₀₀ M9 minimal medya commensal bakterilerin (örneğin, E. coli BW25113/pCM18) sulandırınız ~ 1 kapalı odaları / adalarda komensal biyofilm oluşturan.
2. Pozitif sıvı basıncı uygulayarak adanın duvar kapatın. Ev yapımı bir hava-sıvı basıncı dönüştürücü kanalda hava kabarcığı oluşumunu önlemek için kullanılır.
3. Komensal E. tanıtın coli valf ile adalar içine kapalı ve bakteriler 32 az 1 saat takmak için izin ° C.
4. Unattached bakterilerin yıkayın ve 12 saat 0.25mL/hr seyreltik bakteriyel bir süspansiyon (OD ₆₀₀ ~ 0.05) serpmek.
5. Gevşek bağlı bakteri kaldırmak ve ökaryotik hücre eki için hazırlamak için taze DMEM büyüme medya ile biyofilm durulayın.
6. Resim Leica TCS SP5 Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (Bannockburn, IL) ve biyofilm mimarisi IMARIS ⁵ yazılımı kullanarak görselleştirmek kullanarak biyofilm.

7. Bakteriyel adaları ^6-8 çevresinde ökaryotik hücrelerin Seeding

1. 5 x 10 ⁵ hücre / mL ekim yoğunluğu için DMEM medya doku kültürü şişesi ve tekrar süspansiyon HeLa hücrelerinde Trypsinize.
2. 2 ml / dk Picoplus şırınga pompası (Harvard Apparattus, MA) kullanarak bir akış hızında cihazın içine HeLa hücrelerinde tanıtın. Adanın duvar böylece bakteriyel biyofilm HeLa hücre bölgeden ayrı düşürdü olduğunu emin olun. Bu adım, tohum tekdüzelik tespit edilebilir ve böylece ışık mikroskobu aşamasında yapılmalıdır.
3. % 5 CO ₂ inkübatör kanal ve 37 6 saat inkübe ° C hücre süspansiyon hareketi azaltmak için hücre çıkışı sıkıştırın.
4. Unattached hücreleri çıkarmak için 0.5 ml / saat besi cihazı serpmek.
5. Yenile HeLa ve ortakçı E. DMEM medya coli, her 6 saatte bir.

8. Ada ve ökaryotik hücrelerde maruz patojen bakterilerin Giriş

1. E. hazırlayın coli O157: H7 (EHEC) (moi) 100:1 200:1 (EHEC HeLa hücre başına sayısı) bir enfeksiyon çokluğu HeLa hücreleri enfekte.
2. Durulayın ve gevşek bağlı komensal bakteri yıkayın.
3. Adaları içine seyreltik EHEC süspansiyon (OD ₆₀₀ ~ 0.1) tanıtmak.
4. 37 ° C akışı olmadan 6 saat _süreyle% 5 CO2 inkübatör komensal biyofilm sinyallere maruz kalacağı EHEC izin cihaz inkübe edin.
5. 6 saat HeLa hücrelerinde komensal adalar EHEC maruz PDMS duvar kaldırın.
6. PBS ile kanal durulayın ve Live / Dead kiti (L3224, Invitrogen, CA) kullanılarak canlı ve ölü hücreleri için leke.
7. Zeiss Axiovert 200M floresan mikroskop ve görüntü birden çok yerde, canlı ve ölü hücreleri sayısı tahmin ediyoruz.

9 - Temsilcisi Sonuçlar ⁹

GI yolu enfeksiyonları olaylar dizisi HeLa hücrelerinde bir tek tabaka ve ortakçı E. gelişmekte tarafından taklit edildi coli biyofilm önce komensal biyofilm EHEC HeLa hücreleri enfeksiyona maruz. Mikroakışkan ko-kültür modeli imalatı dahil adımları Şekil 1'de gösterilmiştir. Şekil 2A, ko-kültür cihaz 3 boyutlu render gösterir . Co-kültür cihaz ökaryotik hücre kültür odası ve bakteriyel adanın iki bölge farklı bir renk boyalar (bakteriyel ada için ökaryotik bölgeler ve yeşil mor) Şekil 2B gösterilmiştir. Şekil 2C renk boyalar kullanarak bakteriyel kültür bölgeleri çevreleyen ökaryotik bölgeden izole fizibilite gösterilen Şekil 3 epitel hücreleri ve bakteriler ko-kültür temsilcisi sonuçlarını gösterir. Şekil 3A komensal biyofilm (yeşil) ada kolonizasyonu EHEC (kırmızı). Şekil 3B, epitel hücreleri ve ortakçı E. yan yana gösterir bakteriyel adada EHEC coli. EHEC ve GFP ifade komensal bakteriler ifade RFP epitel hücreleri, bakteri ada izole fizibilite gösteren, PDMS duvar indirdi adada lokalizedir.

Şekil 1: Hücre ekim düzeni ko-kültür modeli. (1) bir ada PDMS duvar oluşturmak için indirilir, ada haline komensal bakteriler tanıtıldı ve fibronektin adanın etrafında aktı. (2) HeLa hücrelerinde adanın çevresindeki bölgelerde numaralı seribaşı. (3) HeLa hücrelerinde izdiham ulaşmak ve komensal biyofilm geliştirmiştir sonra, EHEC adanın içine tanıtıldı. (4) PDMS duvar kaldırdıEHEC için adanın çevresindeki HeLa hücrelerinde açığa kadar. Vanasının Ankastre detayları gösterir.

Şekil 2: epitel hücreleri ve bakteriler ko-kültür için mikroakışkan bir model . Epitel hücreleri arasında bakteriyel adalar oluşturulması için pnömatik tahrikli yakalama bölgeleri gösteren ko-kültür cihazın (A) Üç boyutlu çevrimiyle. Her bakteriyel ada (1200 mikron çap ve 1000 mm arayla), büyüme ortamı sağlanması ve adanın atık kaldırarak için ayrı bir giriş ve çıkış vardır. (B) renk boya ile farklı bölgeler (epitel hücre bölgesine, bakteriyel adalar) gösteren ko-kültür cihaz Mikrografik. (C), pnömatik yakalama sistem sadakat, pnömatik-aktif bir kanal (mavi) kullanarak PDMS duvar (sol panel) düşürücü, kapalı ada mor boya tanıtan ve 48 saat için etrafında sarı boya akan gösterilir PDMS duvar (sağ panel) ortaya çıktığında, adanın bölgenin çevresindeki sarı boya maruz kalmaktadır. Ölçek çubuğu 500 mikron temsil eder.

Şekil 3: Co-HeLa hücre ve bakteri kültürü. (A) RFP ifade EHEC ve GFP ifade E. Floresan görüntü coli BW25113 ada. (B) iletilen Yerleşimi, yeşil ve kırmızı floresan görüntüler cihaz. Ölçek çubuğu 200 mikron temsil eder.

Patojen eki ve kolonizasyon için Konvansiyonel Testler patojenlerin eklenir içine ökaryotik hücrelerin doku kültürü tabak tek tabaka kullanmaktadır. Bu modeller ökaryotik hücreleri üzerinde geliştirilen bir sofrada yemek yiyen bakteri biyofilm dahil değil gibi fizyolojik ilgili değildir. Basit ek ökaryotik hücrelere ön yetişen bir bakteri kültürü biyofilm zamanla gelişecek yüksek yapılar organize olarak bu konformasyon yol açması olası değildir ve neredeyse imkansız değilse kültür ökaryotik hücreler, bakteri varlığı, son derece zordur canlılığında önemli bir kayıp olmadan uzun süre. Patojenlerin epitel hücreleri eklemek için bu modeller bir komensal biyofilm gezinmek olmadığından, bu modellerin doğru GI yolu epitel hücreleri ve komensal bakteriler organizasyonu taklit yok. Burada, ökaryotik hücre ve bakteri ko-kültür için pnömatik kontrollü yakalama kullanan bir mikroakışkan cihaz geliştirme anahat. HeLa hücrelerinde, model model patojen olarak ökaryotik hücre hattı ve EHEC olarak kullanarak, ko-kültür cihaz izole ada bölge tutmak gibi bir HeLa hücre tek tabakalı yetiştirme ve geliştirme ve ortakçı E. destek olduğunu göstermektedir coli biyofilm. Mikroakışkan ko-kültür modeli sofrada yemek yiyen bakteri ve epitel hücreleri lokalizasyonu sağlar, ama aynı zamanda epitel hücreleri karşılaşmadan önce commensal bakterilerin patojenler öncesi ortaya sadece; böylece kolonizasyon sırasında ilgili daha fizyolojik bir ortam sunmak. Buna ek olarak, ortak kültür modeli EHEC enfektivite yanı sıra potansiyel probiyotik suşları tarama gibi uygulamalar için belirli sinyalleri rolünü araştıran odaklanmış temel çalışmalar için faydalı bir araç olabilir.