The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Hindi was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
Warnell School of Forestry and Natural Resources, University of Georgia (UGA)
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 23.20.196.179, User IP: 23.20.196.179, User IP Hex: 387237043
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Lorenz, W. W., Yu, Y., Dean, J. F. D. An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species. J. Vis. Exp. (36), e1751, doi:10.3791/1751 (2010).
भाग 1: ट्री हार्वेस्ट
बाद पेड़ चयनित और felled है, यह महत्वपूर्ण है सावधानी के रूप में और जितना जल्दी संभव हो काम. प्रत्येक अलग ऊतक प्रकार के रूप में काटा जाता है, वे अपने स्वयं के तरल नाइट्रोजन वाहिकाओं में तुरंत रखा जाना चाहिए नमूना सामग्री के किसी भी पार संक्रमण से बचने. यह आरएनए अलगाव प्रोटोकॉल स्केलेबल है.
भाग 2: फ्रीज़र नमूने मिल प्रसंस्करण
भाग 3: शाही सेना अलगाव, दिवस 1
भाग 4: शाही सेना अलगाव, 2 दिन
भाग 5: शाही सेना वर्षा और इथेनॉल धो
भाग 6: अंतिम Resuspension और मात्रा
प्रतिनिधि परिणाम:
आरएनए अलग शंकुवृक्ष ऊतकों रेंज से अलगाव की पैदावार 60-120 से μg / वुडी नमूनों के साथ जी जमी ऊतक आमतौर पर 70-80g / छ जमी ऊतक के आसपास उपज. 260/280 और 260/230 के डायग्नोस्टिक अनुपात दोनों कर रहे हैं आमतौर पर 2.1 की तुलना में अधिक है, और अच्छे संकेतक हैं कि शाही सेना किसी भी महत्वपूर्ण phenolic या कार्बोहाइड्रेट संदूषण से मुक्त नमूना है, क्रमशः. EtBr धुंधला के बाद agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण नमूने 25S, 18s, और 5S शाही सेना (चित्रा 1) के लिए तीन अलग - अलग बैंड दिखाने चाहिए. Agarose जैल पर 18s के लिए 28S के stoichiometry निर्धारण कुछ हद तक व्यक्तिपरक है, और जेल, धुंधला हो जाना, और नमूना लोड के लिए शर्तों चल रहा है जैसे कारकों एक प्रभाव हो सकता है. सामान्य, 28S में: 18s अनुपात> 1.5 के लिए दिखाई देगा. हालांकि, कुछ शंकुवृक्ष नमूने कम अनुपात है. उदाहरण के लिए, Agilent 2100 विश्लेषण के बाद हम विभिन्न प्रकार के ऊतकों जहां stoichiometry 1.2:1 के लिए करीब से शंकुवृक्ष नमूने के कई उदाहरण देखा है. इस प्रकार, एक स्पष्ट कम 28S: 18s agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा stoichiometry जरूरी गरीब गुणवत्ता एक नमूना संकेत नहीं करता है. पत्ता, शूटिंग, और शंकु नमूने अक्सर अतिरिक्त chloroplastic ribosomal RNAs के लिए अलग बैंड कारण वर्तमान. EtBr से सना हुआ सामग्री है कि अच्छी तरह से नमूना या उच्च आणविक जन बैंड (> 8-10 केबी) से विस्थापित नहीं करते आमतौर पर जीनोमिक डीएनए संदूषण (चित्रा 2) से संकेत मिलता है. कम या नीचे 5S बैंड और कम ribosomal बैंड धुंधला हो जाना या एक स्पष्ट 18s> 28S stoichiometry एक अच्छा संकेत है कि शाही सेना गिरावट हुई है (चित्रा 3) आसपास के क्षेत्र में आणविक जन स्मीयरों. Agilent 2100 electropherogram विश्लेषण, बेस लाइन कम और अपेक्षाकृत चिकनी प्रमुख 18s और 28S ribosomal 28S होने RNAs इसी चोटियों के साथ होना चाहिए: 18s अनुपात 1.2 से 2.0 करने के लिए कहीं भी लेकर. Agilent आरएनए वफ़ादारी (RIN) संख्या मान शाही सेना गुणवत्ता के एक बेहतर भविष्यवक्ता हो सकता है और कम से कम 7 या शाही सेना के लिए अधिक से अधिक है कि माइक्रोएरे लक्ष्य की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है होना चाहिए सकता है. चित्रा 4 28S साथ जाइलेम शाही सेना के लिए एक ठेठ Agilent 2100 electropherogram से पता चलता है: 18s 18s: 1.4 करने के लिए बराबर अनुपात और 8.6 का एक RIN मूल्य जबकि 5 चित्रा एक गरीब शाही सेना तैयार करने का एक बहुत ही उच्च आधारभूत और नजर गिरावट होने के रूप में 28S से पता चला जाइलेम से पता चलता है ra0.65 और 3.4 का एक RIN मूल्य के बराबर tio.
चित्रा उच्च गुणवत्ता पाइन शाही सेना के 1. Agarose जेल विश्लेषण. 1 लेन, ठोंग 1 केबी मानक, 2 लेन एक विशिष्ट विशेषता ribosomal 28S, 18s, और 5S बैंड और स्पष्ट 28S के साथ विनोदी पाइन माध्यमिक जाइलेम से कुल शाही सेना अलगाव से पता चलता है: 18s अनुपात> 1.
चित्रा 2. पाइन आरएनए नमूना के agarose जेल विश्लेषण जीनोमिक डीएनए के साथ दूषित है. लेन 1, ठोंग 1 केबी मानक, 2 लेन, जाइलेम शाही सेना जीनोमिक डीएनए संदूषण दिखा नमूना.
चित्रा 3. पाइन नमूना दिखा आरएनए गिरावट और जीनोमिक डीएनए के साथ संदूषण का agarose जेल विश्लेषण . 1 लेन, ठोंग 1 केबी मानक, Lane2, जाइलेम शाही सेना जीनोमिक डीएनए संदूषण और गंभीर आरएनए गिरावट दिखा नमूना.
चित्रा 4 Agilent 2100 electropherogram जाइलेम कुल शाही सेना के विनोदी पाइन जाइलेम पर वर्णित विधि का उपयोग पृथक. 28S: 18s अनुपात 1.4 के बराबर है, RIN मूल्य 8.6 के बराबर होती है
चित्रा 5 Agilent के शिखर टिप कुल गंभीर गिरावट और जीनोमिक प्रदूषण दिखा शाही सेना के 2100 electropherogram. 28S: 18s अनुपात 0.65 के बराबर है, RIN मूल्य 3.4 के बराबर होती है
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
शंकुवृक्ष प्रजातियों से प्राप्त उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए phenolic और polysaccharide वुडी ऊतकों में पाया यौगिकों के उच्च स्तर को देखते हुए एक मुश्किल काम हो सकता है. चांग एट अल द्वारा विकसित प्रोटोकॉल के साथ शुरू. (1), हम है कि अधिक कठोर निष्कर्षण पाया है और विभिन्न वुडी और गैर - वुडी ऊतकों शंकुवृक्ष प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता से नमूना से बहुत उच्च गुणवत्ता वाले कुल शाही सेना के लगातार अलगाव के लिए नेतृत्व चरणों साफ. यह वीडियो न केवल हमारे संशोधित आरएनए अलगाव प्रोटोकॉल, लेकिन यह भी क्षेत्र के संग्रह और विनोदी पाइन के लिए पहले प्रयोग किया जाता अलगाव शाही सेना प्रसंस्करण तकनीकों में उठाए गए कदमों का प्रदर्शन किया है. इन कटाई और तैयारी चरणों का समान रूप से महत्वपूर्ण हैं क्षेत्र एकत्र नमूनों में शाही सेना क्षरण कम से कम, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दोनों शाही सेना गुणवत्ता और कुल उपज में वृद्धि. सबसे महत्वपूर्ण, हमने पाया है कि इस विधि का उपयोग शाही सेना के लिए अन्य तरीकों PtGen2 विनोदी सनोबर माइक्रोएरे (2) के खिलाफ संकरण के लिए माइक्रोएरे लक्ष्य तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया की तुलना में सीडीएनए संश्लेषण की पैदावार में वृद्धि हुई नेतृत्व तैयार है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
डा. जो Nairn, मैट Bryman, माइकल बोर्डो, Ujwal Bagal, Huizhe जिन, और अमांडा Bouffier: हम बिना निम्नलिखित व्यक्तियों जिनकी मदद पाइन ऊतकों के संग्रह संभव नहीं होता को धन्यवाद देना चाहूंगा.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | |
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | |
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | ||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | ||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | ||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | ||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #05-562-16B | |
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #05-562-10K | |
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR international | #21008-939 | |
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #2302830 | |
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion | #AM12425 |
