Een verbeterde methode van RNA isolatie uit Loblolly Pine ( P. taeda L.) en andere naaldbomen

Deel 1: Boom Harvest

Nadat de boom is geselecteerd en gekapt, is het belangrijk om te werken als zorgvuldig en zo snel mogelijk. Aangezien elke ander weefseltype wordt geoogst, moeten ze onmiddellijk worden geplaatst in hun eigen vloeibare stikstof vaartuigen om elke kruisbesmetting van het monster materiaal te voorkomen. Deze RNA-isolatie protocol is schaalbaar.

1. Snijd bouten in lengten van ca. 0,5-0,75 m en met een kettingzaag de schors score in twee of drie plaatsen naar aanleiding van de lengte-as van de bout.
2. Met behulp van een houten beitel, het werk van de rand van de regio scoorde totdat de schors begint af te scheiden van het hout en het werken van de beitel terwijl u terug op het gedeelte van schors blijven totdat het volledig scheidt van de stam.
3. Secundaire xyleem is geoogst met een rechte rand, enkelzijdig scheermes door schrapen langs de lengte-as van de bout die is ontdaan van de bast. Draag latex handschoenen om besmetting van het weefsel te minimaliseren.
4. Floëem, die is gelegen aan de binnenzijde van de schors secties, is gemakkelijk geoogst door handmatig pellen.
5. Reactie hout is verzameld uit de onderkant van de ledematen na het markeren met verf op hun oorspronkelijke oriëntatie geven ten opzichte van de grond.
6. Ledematen zijn gesneden in bouten van 1-2 m en scoorde aan weerszijden langs de lengteas op basis van de geschatte locaties van de twee soorten reacties hout: tegenover hout (aan de bovenkant van de ledemaat) en de compressie hout (aan de onderkant kant van de ledematen). De schors is gescheiden van de ledemaat, zoals hierboven beschreven, behalve dat alleen de schors met betrekking tot elk type reactie hout wordt verwijderd in een keer. Secundaire xyleem of floëem wordt dan verzameld zoals hierboven beschreven en geplaatst in vloeibare stikstof.
7. Andere monsters, zoals naalden, schiet tips en jonge kegels, kunnen worden geoogst met de hand of met behulp van snoeischaren als nodig is.
8. Verzamelde monsters ingevroren in vloeibare stikstof moet worden geplaatst in gemarkeerd zakken of geschikte containers en verpakt in droog ijs voor verzending naar het laboratorium.

Deel 2: Vriezer Mill verwerking van de monsters

1. Vul de Spex 6850 vriezer molen reservoir met vloeibare stikstof en het milieu-effectenrapport bar in een van de schuren flacons en te vullen met vloeibare stikstof om pre-chill. Giet vloeibare stikstof en voeg het monster toe aan de injectieflacon.
2. Zorg dat er geen overtollige vloeibare stikstof blijft in de maalkamer en dat een teveel stikstof gas is volledig ontlucht voor het einde dop zit aan de kamer verzegelen.
3. Plaats de flacon malen in de transporteur en te sluiten.
4. Molen bosrijke monsters voor twee cycli van 1 minuut / cyclus bij een snelheid instelling van 14.
5. Gebruik een vloeibare stikstof gekoelde spatel om de gemalen monster (houtmeel) te verwijderen in een bekerglas dat is pre-gekoeld en bevat een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof.
6. Giet de vloeibare stikstof / monster slurrie in een opslagcontainer en plaats bij -80 ° C totdat het nodig is.

Deel 3: RNA isolatie, Dag 1

1. Plaats 20 ml van RNA isolatie Buffer in een 50 ml Falcon buis bedekte en voeg 400 ul β-mercapto-ethanol, vortex kort en warmte in een 60 ° C waterbad.
2. Voeg 4 g van bevroren weefsel aan elke buis. Dop en schud krachtig met de hand, gevolgd door vortexen gedurende 10 seconden.
3. Voeg een gelijk volume van chloroform aan de buis en het omkeren voorzichtig om te mengen. Plaats de buis op een draaiend wiel en laat end-over-end mengen gedurende 5 minuten.
4. Giet het mengsel in een 50 mL Oak Ridge buis en centrifugeer op 12.000 (17.200 xg) tpm in een SS34 vaste-hoek rotor gedurende 5 minuten.
5. Breng de waterige fase naar een nieuwe Oak Ridge buis en voeg een half-volume van de chloroform.
6. Vortex gedurende 1 minuut en verder mixen op een roterend wiel gedurende 5 minuten. Centrifugeer bij 12.000 tpm (17200 xg) in een vaste hoek rotor SS34 gedurende 5 minuten.
7. Breng de waterige fase in de frisse Oak Ridge buis en voeg een half-volume van de chloroform. Vortex gedurende 1 minuut. Centrifugeer bij 12.000 tpm (17200 xg) in een vaste hoek rotor SS34 gedurende 10 minuten.
8. Breng de waterige fase naar een 50 ml met hoge snelheid polypropyleen buis. Centrifugeer bij 10.000 tpm (11900 xg) in een vaste hoek rotor SS34 gedurende 20 minuten.
9. Giet supernatant in 50 ml Falcon buis en voeg een kwart-volume 10 M LiCl oplossing voor supernatant. Kort vortex en plaats bij 4 ° C voor overnachting neerslag.

Deel 4: RNA isolatie, Dag 2

1. Warmte SSTE buffer in een 65 ° C waterbad voorafgaand aan het starten.
2. Giet de LiCl-neergeslagen monster in een polypropyleen buis en pellet het RNA door centrifugeren bij 11000 rpm in een SS34 vaste hoek rotor (14.450 xg) gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
3. Na het centrifugeren,Giet af en gooi de vloeistof, en draai de buisjes op Kimwipes voor ongeveer 1 minuut. Pipetteer uit de resterende supernatant.
4. Resuspendeer elke pellet in 800 ui van verwarmde SSTE met een pipet om grondig te mengen van de monsters. Overdracht de geresuspendeerde monster 2 ml Ambion RNAse-vrij microcentrifuge buizen.
5. Warmte monsters bij 65 ° C gedurende 2 minuten gevolgd door krachtige vortexen om volledige resuspensie te verzekeren.
6. Voeg een gelijk volume fenol-chloroform, pH8, aan elk monster buis. Vortex elk monster gedurende 30 seconden en dan draaien in een microfuge bij 14.000 rpm gedurende 3 minuten
7. Breng de waterige fase naar een nieuw 2 ml Ambion RNAse-vrij microfugebuizen buizen, en voeg een gelijk volume van chloroform. Vortex elk monster gedurende 30 seconden en spin in het microfuge bij 14.000 rpm gedurende 3 minuten.
8. Overdracht waterige fase naar fase-Lock Gel buizen die eerder zijn opgesteld door microfuging bij 11.000 rpm gedurende 2 minuten. Voeg een half-volume van chloroform en voorzichtig pipet te mengen.
9. Centrifugeer bij 11.000 rpm gedurende 5 minuten en breng de waterige fase in de frisse 2 ml Ambion RNAse-vrij microcentrifuge buizen.

Deel 5: RNA Neerslag en Ethanol Wash

1. Voeg 50 uL 3,0 M natriumacetaat, pH 4,8, en 1 ml 100% ethanol aan de waterfase. Vortex en neerslag in de -80 ° C gedurende 30 minuten of overnacht bij -20 ° C.
2. Microfuge monsters bij 14.000 rpm gedurende 30 minuten bij 4 ° C, en zorgvuldig aspireer uit het supernatans. Niet verstoren van de pellet.
3. Was de RNA-pellets met een mL -20 ° C 70% (v / v) ethanol. Microfuge bij 14.000 rpm gedurende 1 minuut en zuig af van de ethanol.
4. Herhaal stap 5.3.
5. Haal het beschermkapje van de buizen en drogen aan de lucht pellets op de bank voor 3-5 minuten.

Deel 6: Final resuspensie en kwantificering

1. Resuspendeer elke pellet in 100 ui DEPC-behandeld water. En door vortexen gemengd en incubeer de buizen bij 65 ° C gedurende 2 minuten voordat u op ijs. Herhaal indien nodig om te proeven resuspensie te verzekeren.
2. Pool zoals monsters, indien gewenst en maak 50 ul van een 1:10 verdunning in 10 mM Tris, pH 7,5, voor spectrofotometrische kwantificering. Absorptie ratio's voor 260/280 en 260/230 zijn meestal groter dan 2.1 en 2.2, respectievelijk. RNA-isolatie opbrengst varieert van 60-120μg / g bevroren weefsel.
3. Analyseren van monsters door het uitvoeren van 1.5-2.5 microgram RNA op een 1% agarosegel in TAE buffer. Voor meer kritische monsters, het analyseren van de RNA met behulp van een Agilent 2100 Bioanalyzer volgens de instructies van de fabrikant.

Representatieve resultaten:

RNA-isolatie opbrengsten van de verschillende weefsels conifeer range 60 tot 120 ng / g bevroren weefsel met houtachtige monsters typisch waardoor ongeveer 70-80g / g bevroren weefsel. Diagnostische verhoudingen van 260/280 en 260/230 zijn beide doorgaans hoger dan 2,1, en zijn goede indicatoren die de RNA-monster is vrij van elke significante fenol-of koolhydraten besmetting respectievelijk. Monsters geanalyseerd met behulp van agarose gelelektroforese gevolgd door EtBr kleuring moet blijken drie verschillende bands voor 25S, 18S en 5S RNA (figuur 1). Het bepalen van de stoichiometrie van de 28S aan 18S op agarose gels is enigszins subjectief, en factoren zoals hardlopen voorwaarden voor de gel, vlekken, en sample belasting kan hebben allemaal een effect hebben. In het algemeen, de 28S: 18S verhouding zal blijken te zijn> 1,5. Echter, sommige coniferen monsters hebben een lagere ratio's. Bijvoorbeeld het volgen van Agilent 2100 analyse hebben we gezien een aantal voorbeelden van coniferen monsters uit verschillende weefseltypen, waar de stoichiometrie dichter bij 1,2:1. Zo, een schijnbaar geringe 28S: 18S doet stoichiometrie door agarosegelelektroforese niet noodzakelijkerwijs op een slechte kwaliteit monster. Leaf, schieten, en kegel monsters hebben vaak extra verschillende bands aanwezig zijn als gevolg van ribosomaal RNA's chloroplastic. EtBr-gekleurde materialen die niet migreren van het monster goed of hoog moleculair gewicht bands (> 80 tot 10 kb) duiden er meestal op genomisch DNA contaminatie (figuur 2). Met een laag moleculair gewicht uitstrijkjes in de buurt van of onder de 5S band en een verminderde ribosomaal band vlekken of een schijnbare 18S> 28S stoichiometric is een goede indicator dat RNA degradatie heeft plaatsgevonden (figuur 3). In de Agilent 2100 electropherogram analyse, de basis lijn moet een laag en relatief glad zijn met grote pieken die overeenkomen met 18S en 28S ribosomaal RNA's met 28S: 18S verhoudingen variërend overal 1,2 tot 2,0. De Agilent RNA Integrity Number (RIN) waarde kan een betere voorspeller van RNA kwaliteit zijn en moet minimaal 7 of hoger voor het RNA dat moet worden gebruikt voor de bereiding van microarray doelen. Figuur 4 toont een typische Agilent 2100 electropherogram voor xyleem RNA met een 28S: 18S-verhouding van 1,4 en een RIN waarde van 8,6, terwijl Figuur 5 toont een slechte xyleem RNA prep met een zeer hoge baseline en merkbare degradatie zoals blijkt uit de 28S: 18S ratio die gelijk is aan 0,65 en een RIN waarde van 3,4.

Figuur 1. Agarose gel analyse van hoge-kwaliteit grenen RNA. Laan 1, NEB een kb standaard, Lane 2 toont een typische totaal RNA geïsoleerd van loblolly pine secundaire xyleem met karakteristieke ribosomale 28S, 18S en 5S bands en schijnbare 28S: 18S-ratio> 1.

Figuur 2. Agarose gel analyse van den RNA monster besmet met genomisch DNA. Laan 1, NEB een kb standaard, Lane 2, xyleem RNA-monster met genomisch DNA besmetting.

Figuur 3. Agarose gel analyse van den monster met RNA-degradatie en besmetting met genomisch DNA. Laan 1, NEB een kb standaard, Lane2, xyleem RNA-monster met genomisch DNA vervuiling en ernstige RNA degradatie.

Figuur 4. Agilent 2100 electropherogram van xyleem totaal RNA geïsoleerd met behulp van de beschreven methode loblolly pine xyleem. 28S: 18S-ratio is gelijk aan 1,4, RIN waarde is gelijk aan 8,6

Figuur 5. Agilent 2100 electropherogram van apicale tip totaal RNA die ernstige degradatie en genomische besmetting. 28S: 18S-ratio is gelijk aan 0,65, RIN waarde is gelijk aan 3,4

Het verkrijgen van hoge kwaliteit RNA uit naaldbomen, kan een moeilijke taak, gezien de hoge niveaus van fenol-en polysaccharide verbindingen aangetroffen in bosrijke weefsels. Te beginnen met het protocol ontwikkeld door Chang et al.. (1), hebben we ontdekt dat een strengere extractie en clean-up treden leiden naar de consistente isolatie van zeer hoge kwaliteit totaal RNA uit diverse houtige en niet-houtige weefsels bemonsterd uit een breed scala van naaldbomen. Deze video heeft aangetoond dat niet alleen onze gewijzigd RNA-isolatie protocol, maar ook de stappen die in het veld verzamelen en verwerken van technieken die gebruikt worden voor loblolly pine voorafgaand aan de isolatie RNA. Deze oogst en de voorbereiding stappen zijn even belangrijk om RNA degradatie te minimaliseren in het veld-verzamelde monsters, maar ook om zowel RNA kwaliteit en de totale opbrengst te verhogen. Het belangrijkst, hebben we ontdekt dat RNA bereid met behulp van deze methode heeft geleid tot cDNA synthese opbrengst steeg in vergelijking met andere methoden gebruikt om microarray doelen voor te bereiden op hybridisatie tegen de PtGen2 loblolly dennen microarray (2).