En förbättrad metod av RNA Isolering från Loblolly Pine ( P. taeda L.) och andra arter av barrträd

Del 1: Träd Harvest

När trädet är vald och avverkade är det viktigt att arbeta så noggrant och så fort som möjligt. Eftersom varje annan vävnadstyp avverkas, bör de placeras omedelbart till sin egen flytande kväve fartyg för att undvika korskontaminering av provmaterial. Detta RNA isolering protokoll är skalbar.

1. Skär bultarna i längder på ca 0,5-0,75 m och med en motorsåg poäng barken i två eller tre ställen efter längdaxel bulten.
2. Använda ett stämjärn, arbete i utkanten av poäng regionen tills barken börjar att släppa från skogen och fortsätta arbeta mejseln samtidigt dra tillbaka den del av barken tills den separerar helt från stammen.
3. Sekundär xylem skördas med en rak, enkelsidig rakkniv genom att skrapa längs den längsgående axeln på bulten som har barkat. Använd latexhandskar för att minimera kontaminering av vävnaden.
4. Floem, som ligger på insidan av barken sektioner, lätt skördas manuellt peeling.
5. Reaktion trä samlas in från undersidan av armar och ben efter att markera dem med sprayfärg för att markera dess ursprungliga orienteringen i förhållande till marken.
6. Lemmar är skuren i bultar på 1-2 m och fick på motsatta sidor längs den längsgående axeln enligt den ungefärliga placeringen av de två typerna av reaktioner trä: motsatta trä (på ovansidan av lem) och komprimering av trä (på botten sidan av extremitet). Barken är separerad från lem som beskrivits ovan, förutom att bara barken som täcker varje typ av reaktion trä tas bort på en gång. Sekundär xylem eller floem samlas sedan upp enligt ovan och placeras i flytande kväve.
7. Andra prover, som nålar, skjuta tips och unga kottar, kan skördas för hand eller med Sekatörer som krävs.
8. Insamlade prover frysta i flytande kväve ska placeras i märkta påsar eller lämpliga kärl och förpackas i kolsyreis för transport tillbaka till laboratoriet.

Del 2: Frys Mill Behandling av prover

1. Fyll Spex 6850 reservoaren frys kvarn med flytande kväve och placera den inverkan baren i en av slipning flaskor och fyll den med flytande kväve för att pre-chill. Häll bort flytande kväve och lägga prov till flaskan.
2. Se till att ingen överflödig vätska kväve kvar i fräsning kammare och att överdriven kvävgas är helt ventileras före slutet toppen sitter för att försegla kammaren.
3. Sätt slipning injektionsflaskan i transportören och nära.
4. Mill Woody prover för två cykler på 1 minut / cykel i en takt inställning av 14.
5. Använd en flytande kväve kyld spateln för att ta bort malt prov (trämjöl) i en bägare som har pre-kylda och innehåller en liten mängd flytande kväve.
6. Häll flytande kväve / prov slam i ett förråd och placera vid -80 ° C tills det behövs.

Del 3: RNA Isolering, dag 1

1. Placera 20 ml av RNA Isolering bufferten i ett 50mL tak Falcon rör och tillsätt 400 mikroliter β-merkaptoetanol, vortex kort, sedan värme i en 60 ° C vattenbad.
2. Tillsätt 4 g fryst vävnad till varje rör. Cap och skaka kraftigt för hand följt av vortexa i 10 sekunder.
3. Tillsätt en motsvarande volym av kloroform till röret och vänd försiktigt för att blanda. Placera röret på ett roterande hjul och låta slut-over-end-blandning i 5 minuter.
4. Häll blandningen i en 50 ml Oak Ridge röret och centrifugera vid 12 tusen (17.200 xg) rpm i en SS34 fast-vinkel rotor för 5 minuter.
5. Överför vattenfasen till en ny Oak Ridge röret och lägga en halv volym kloroform.
6. Vortex i 1 minut och fortsätta blanda på ett roterande hjul i 5 minuter. Centrifugera vid 12.000 rpm (17.200 xg) i en SS34 fast vinkel rotor i 5 minuter.
7. Överför vattenfasen till frisk Oak Ridge röret och lägga en halv volym kloroform. Vortex i 1 minut. Centrifugera vid 12.000 rpm (17.200 xg) i en SS34 fast vinkel rotor för 10 minuter.
8. Överför vattenfasen till en 50 ml hög hastighet polypropylen rör. Centrifugera vid 10000 rpm (11.900 xg) i en SS34 fast vinkel rotor för 20 minuter.
9. Dekantera supernatanten i 50 ml Falcon rör och lägga till en kvarts volym 10 M LiCl lösning på supernatanten. Kortfattat Vortex och plats vid 4 ° C över natten nederbörd.

Del 4: RNA Isolering, dag 2

1. Värme SSTE buffert i ett 65 ° C vattenbad före start.
2. Häll LiCl-fällt provet i en polypropylen rör och pellets RNA genom centrifugering vid 11.000 rpm i en SS34 fast vinkel rotor (14.450 xg) i 30 minuter vid 4 ° C.
3. Efter centrifugering,Häll av och släng vätskan och vänd rören på Kimwipes i ca 1 minut. Pipettera bort eventuell kvarvarande supernatant.
4. Resuspendera varje pelleten i 800 mikroliter av uppvärmd SSTE hjälp av en pipett för att blanda proverna. Överför den återsuspenderade provet till 2 mL Ambion RNAse-fri mikrofugrör rör.
5. Värm prover vid 65 ° C under 2 minuter följt av kraftig vortexa att säkerställa fullständigt upplöst.
6. Tillsätt en motsvarande volym av fenol-kloroform, pH8, till varje provrör. Vortexa varje prov i 30 sekunder och sedan snurra i ett mikrofugrör vid 14.000 rpm i 3 minuter
7. Överför vattenfasen till en ny 2ml Ambion RNAse-fri mikrofugrör rör och tillsätt en lika stor volym kloroform. Vortexa varje prov i 30 sekunder och snurra i mikrofugrör vid 14.000 rpm i 3 minuter.
8. Överför vattenfasen till fas-Lock Gel rör som tidigare har utarbetats av microfuging vid 11.000 rpm i 2 minuter. Lägg till en halv-volym kloroform och försiktigt pipetten för att blanda.
9. Centrifugera vid 11.000 rpm i 5 minuter och överföra vattenfasen till frisk 2ml Ambion RNAse-fri mikrofugrör rör.

Del 5: RNA Nederbörd och etanol Wash

1. Tillsätt 50 mikroliter 3,0 M natriumacetat, pH 4,8 och 1 ml 100% etanol till vattenfasen. Vortex och fällningen i -80 ° C i 30 minuter eller över natten vid -20 ° C.
2. Mikrofugrör prover vid 14.000 rpm i 30 minuter vid 4 ° C, och försiktigt aspirera bort supernatanten. Stör inte pelleten.
3. Tvätta RNA pellets med 1 ml -20 ° C 70% (v / v) etanol. Mikrofugrör vid 14.000 rpm i 1 minut och aspirera från etanol.
4. Upprepa steg 5,3.
5. Ta bort skyddet från rören och lufttorka pellets på bänken i 3-5 minuter.

Del 6: Final resuspension och kvantifiering

1. Resuspendera varje pelleten i 100 mikroliter DEPC-behandlat vatten. Blanda genom att vortexa och inkubera rören vid 65 ° C i 2 minuter innan de placeras på is. Upprepa vid behov för att säkerställa prov resuspension.
2. Pool Gillar prover om så önskas och gör 50 mikroliter en 1:10 spädning i 10 mM Tris, pH 7,5, för spektrofotometrisk kvantifiering. Absorbans nyckeltal för 260/280 och 260/230 är vanligtvis större än 2,1 och 2,2, respektive. RNA-isolering ger allt från 60-120μg / g fryst vävnad.
3. Analysera prover genom att köra 1,5-2,5 mikrogram RNA från 1% agarosgel i TAE buffert. För mer kritiska prover, analysera RNA med hjälp av en Agilent 2100 Bioanalyzer enligt tillverkarens anvisningar.

Representativa resultat:

RNA isolering avkastningen från olika barrträd vävnader rad 60 till 120 mikrogram / g fryst vävnad med Woody prover ger vanligtvis runt 70-80g / g fryst vävnad. Diagnostiska förhållandet mellan 260/280 och 260/230 är både normalt större än 2,1 och är goda indikatorer på att RNA-provet är fri från väsentliga fenol eller kolhydrater förorening, respektive. Proverna analyseras med agarosgelelektrofores följt av EtBr färgning ska visa tre olika band för 25S, 18S och 5S RNA (Figur 1). Fastställande av stökiometri av 28S till 18S på agarosgeler är något subjektivt, och faktorer såsom löpning villkor för gel, färgning, och prov belastning kan alla ha en effekt. I allmänhet 28S: 18S förhållandet ser ut att vara> 1,5. Men vissa barrträd prover har lägre nyckeltal. Till exempel följande Agilent 2100 analyser har vi sett flera exempel på barrträd prover från olika vävnadstyper där stökiometri är närmare 1,2:1. Således en uppenbar låg 28S: gör 18S stökiometri med agarosgelelektrofores anger inte nödvändigtvis en dålig kvalitet prov. Leaf, skjuta, och kon prover måste ofta ytterligare distinkta band närvarande på grund av chloroplastic ribosomala RNA. EtBr-färgade material som inte flyttar från provet bra eller hög molekylvikt band massa (> 8-10 kb) indikerar vanligtvis arvsmassans DNA föroreningar (figur 2). Låg molekylvikt smetar i närheten av eller under 5S bandet och minskad ribosomal band färgning eller en uppenbar 18S> 28S stökiometri är en bra indikator att RNA nedbrytning har skett (Figur 3). I Agilent 2100 electropherogram analysen bör baslinjen vara låg och relativt mjuk med stora toppar som motsvarar 18S och 28S ribosomal RNA ha 28S: 18S nyckeltal varierar allt från 1,2 till 2,0. Den Agilent RNA Integrity Number (RIN) värde kan vara en bättre prediktor för RNA kvalitet och bör vara minst 7 eller större för RNA som ska användas för beredning av microarray mål. Figur 4 visar ett typiskt Agilent 2100 electropherogram för xylem RNA med en 28S: 18S förhållande lika med 1,4 och en RIN värde på 8,6 medan Figur 5 visar en dålig xylem RNA-prep som har en mycket hög baslinjen och märkbar försämring vilket framgår av den 28S: 18S RATio lika med 0,65 och en RIN värde på 3,4.

Figur 1. Agarosgel analys av hög kvalitet furu RNA. Lane 1, NEB 1 kB standard, visar Lane 2 en typisk total RNA isolering från Loblolly tall sekundära xylem med karakteristiska ribosomala 28S, 18S och 5S band och uppenbara 28S: 18S kvoten> 1.

Figur 2. Agarosgel analys av tall RNA prov förorenade med genomisk DNA. Lane 1, NEB 1 kB standard, Lane 2, xylem RNA-prov visar arvsmassans DNA kontamination.

Figur 3. Agarosgel analys av tall prov visar RNA degradering och förorening med genomisk DNA. Lane 1, NEB 1 kB standard, Lane2, xylem RNA-prov visar arvsmassans DNA föroreningar och svår RNA nedbrytning.

Figur 4. Agilent 2100 electropherogram av RNA xylem totalt isoleras med hjälp av den beskrivna metoden på Loblolly tall xylem. 28S: 18S förhållandet utgör 1,4, lika RIN värde 8,6

Figur 5. Agilent 2100 electropherogram av apikala spets totala RNA visar allvarlig nedbrytning och genomiska föroreningar. 28S: 18S förhållandet är lika 0,65, motsvarar RIN värde 3,4

Erhålla hög kvalitet RNA från barrträd arter kan vara en svår uppgift med tanke på de höga nivåer av fenoliska och polysackarid föreningar som finns i Woody vävnader. Från och med protokoll som utvecklats av Chang et al. (1), har vi funnit att strängare utvinning och städa upp trappsteg leder till en konsekvent isolering av mycket hög kvalitet totala RNA från olika Woody och icke vedartade vävnader plockats från en mängd olika barrträd arter. Denna video har visat inte bara vår modifierade RNA isolering protokoll, men också de steg som tagits i fält för insamling och bearbetning används för Loblolly tall före RNA isolering. Dessa skörd och beredning steg är lika viktiga för att minimera RNA nedbrytning i fält samlas in-prov, samt att öka både RNA kvalitet och total avkastning. Det viktigaste har vi funnit att RNA-förberedd med den här metoden har lett till ökad cDNA syntes avkastning jämfört med andra metoder som används för att förbereda microarray mål för hybridisering mot PtGen2 Loblolly tall microarray (2).