Un metodo migliorato di isolamento dell'RNA da Pino Loblolly ( P. taeda L.) e altre specie di conifere

Parte 1: Harvest Albero

Dopo che l'albero viene selezionato e abbattuto, è importante lavorare con la stessa cura e il più rapidamente possibile. Come ogni tipo di tessuto diverso è raccolto, che dovrebbe essere messo immediatamente in loro pescherecci azoto liquido per evitare qualsiasi contaminazione del materiale del campione. Questo protocollo di isolamento del RNA è scalabile.

1. Tagliare i bulloni in lunghezze di circa 0,5-0,75 metri e con un punteggio motosega la corteccia in due o tre posti dopo l'asse longitudinale del bullone.
2. Utilizzando uno scalpello in legno, opera ai margini della regione ha segnato fino a quando la corteccia comincia a separare dal legno e continuare a lavorare lo scalpello mentre si tira indietro sulla parte di corteccia fino a quando non separa completamente dal fusto.
3. Xilema secondario viene raccolto con un regolo, rasoio solo lato raschiando lungo l'asse longitudinale del bullone che è stato spogliato della corteccia. Guanti in lattice per minimizzare la contaminazione del tessuto.
4. Floema, che si trova sul lato interno delle sezioni corteccia, viene prontamente raccolto da manuale peeling.
5. Legno di reazione viene raccolto dalla parte inferiore degli arti dopo aver segnato con vernice spray per indicare il loro orientamento originale rispetto al suolo.
6. Gli arti sono tagliati in rotoli di m 1-2 e segnato ai lati opposti lungo l'asse longitudinale secondo la posizione approssimativa dei due tipi di legno di reazione: legno opposto (sul lato superiore dell'arto) e legno di compressione (sul fondo lato dell'arto). La corteccia è separato dal arto, come descritto sopra, eccetto che solo la corteccia copre ogni tipo di legno di reazione viene rimosso in una sola volta. Xilema o floema secondario viene poi raccolto come sopra descritto e posto in azoto liquido.
7. Altri campioni, come aghi, suggerimenti sparare e coni giovani, possono essere raccolte a mano o usando forbici come richiesto.
8. Campioni raccolti congelati in azoto liquido deve essere posto in sacchi marcati o contenitori idonei e confezionati in ghiaccio secco per tornare spedizione al laboratorio.

Parte 2: Mulino di elaborazione congelatore dei campioni

1. Riempire il serbatoio Spex 6850 mulino congelatore con azoto liquido e posizionare la barra di impatto in una delle fiale di macinazione e riempire con azoto liquido pre-chill. Eliminare azoto liquido e aggiungere campione flaconcino.
2. Assicurarsi che nessun eccesso di azoto liquido resta nella camera di fresatura e che il gas azoto in eccesso viene scaricata completamente prima che il tappo è seduto per sigillare la camera.
3. Inserire la fiala di rettifica nel supporto e chiudere.
4. Campioni legnosi mulino per due cicli di 1 minuto / ciclo a un'impostazione di velocità di 14.
5. Utilizzare una spatola di azoto liquido refrigerato per rimuovere l'esempio lavorato (farina di legno) in un bicchiere che è stato pre-refrigerati e contiene una piccola quantità di azoto liquido.
6. Versate il liquido di azoto / campione impasto in un contenitore e luogo di stoccaggio a -80 ° C fino al momento dell'uso.

Parte 3: Isolamento di RNA, Giorno 1

1. Mettere 20 mL di tampone di isolamento di RNA in un tubo ricoperto 50mL Falcon e aggiungere 400 microlitri β-mercaptoetanolo, vortice brevemente, poi il calore in un bagno d'acqua a 60 ° C.
2. Aggiungere 4 g di tessuto congelato ad ogni provetta. Tappo e agitare vigorosamente a mano seguita da vortex per 10 secondi.
3. Aggiungere un uguale volume di cloroformio al tubo e capovolgere delicatamente per mescolare. Posizionare il tubo su una ruota in movimento e permettono end-over-end mescolando per 5 minuti.
4. Decantare la miscela in un tubo da 50 ml Ridge Oak e centrifugare a 12.000 (17.200 xg) giri in un angolo fisso rotore SS34 per 5 minuti.
5. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta Oak Ridge e aggiungere un mezzo volume di cloroformio.
6. Vortex per 1 minuto e continuare a mescolare su una ruota girevole per 5 minuti. Centrifugare a 12.000 giri (17.200 xg) in un rotore SS34 angolo fisso per 5 minuti.
7. Trasferire la fase acquosa a tubo fresco di Oak Ridge e aggiungere un mezzo volume di cloroformio. Vortex per 1 minuto. Centrifugare a 12.000 giri (17.200 xg) in un rotore SS34 angolo fisso per 10 minuti.
8. Trasferire la fase acquosa in un tubo 50 ml in polipropilene ad alta velocità. Centrifugare a 10.000 rpm (11.900 xg) in un rotore SS34 angolo fisso per 20 minuti.
9. Surnatante decantare in tubo da 50 ml Falcon e aggiungere un quarto volume di 10 M soluzione di LiCl di supernatante. Mescolare brevemente nel vortex e posto a 4 ° C per le precipitazioni durante la notte.

Parte 4: RNA Isolamento, Giorno 2

1. Calore tampone SSTE in un bagno d'acqua a 65 ° C prima di iniziare.
2. Versare il LiCl precipitato a campione in un tubo di polipropilene e pellet l'RNA mediante centrifugazione a 11.000 rpm in un rotore SS34 angolo fisso (14.450 xg) per 30 minuti a 4 ° C.
3. Dopo la centrifugazione,versare al largo e gettare il liquido, e invertire i tubi in Kimwipes per circa 1 minuto. Pipetta fuori qualsiasi surnatante rimanente.
4. Risospendere ogni pellet in 800 ml di SSTE riscaldata utilizzando una pipetta per mescolare completamente i campioni. Trasferire il campione risospeso in 2 mL Ambion RNasi-free tubi microcentrifuga.
5. Campioni di calore a 65 ° C per 2 minuti, seguita da vortex vigorosa per garantire la completa risospensione.
6. Aggiungere un uguale volume di fenolo-cloroformio, pH8, ad ogni provetta. Vortex ogni campione per 30 secondi e poi girare in una microcentrifuga a 14.000 giri al minuto per 3 minuti
7. Trasferire la fase acquosa in una nuova Ambion 2 ml RNasi-free tubi microcentrifuga, e aggiungere un uguale volume di cloroformio. Vortex ogni campione per 30 secondi e spin in microcentrifuga a 14.000 giri al minuto per 3 minuti.
8. Trasferimento fase acquosa alla fase-Lock Gel tubi che sono stati precedentemente preparati da microfuging a 11.000 rpm per 2 minuti. Aggiungere un mezzo volume di cloroformio e mescolare delicatamente pipetta.
9. Centrifugare a 11.000 rpm per 5 minuti e trasferire la fase acquosa a fresco 2 ml Ambion RNasi-free tubi microcentrifuga.

Parte 5: RNA Precipitazioni e Wash Etanolo

1. Aggiungere 50 microlitri di acetato di sodio 3,0 M, pH 4.8, e 1 mL di etanolo al 100% alla fase acquosa. E precipitare nel vortice -80 ° C per 30 minuti o tutta la notte a -20 ° C.
2. Campioni microcentrifuga a 14.000 rpm per 30 minuti a 4 ° C, e con attenzione aspirare il sopranatante. Non disturbare il pellet.
3. Lavare il pellet con 1 ml di RNA a -20 ° C il 70% (v / v) di etanolo. Microcentrifuga a 14.000 rpm per 1 minuto e aspirare fuori l'etanolo.
4. Ripetere il punto 5.3.
5. Stappare i tubi e aria secca pellet in panchina per 3-5 minuti.

Parte 6: Resuspension finale e quantificazione

1. Risospendere ogni pellet in 100 l DEPC-acqua trattata. Mescolare nel vortex e incubare le provette a 65 ° C per 2 minuti prima dell'immissione sul ghiaccio. Ripetere se necessario per garantire la risospensione del campione.
2. Piscina come campioni se lo si desidera e fare 50 ml di una diluizione 1:10 in 10mM Tris, pH 7,5, per la quantificazione spettrofotometrica. Rapporti di assorbanza per 260/280 e 260/230 sono in genere superiori a 2.1 e 2.2, rispettivamente. RNA gamma isolamento rese dal 60-120μg / g di tessuto congelato.
3. Analizzare campioni eseguendo 1,5-2,5 mg di RNA su un 1% gel in tampone TAE. Per ulteriori campioni sensibili, analizzare la RNA utilizzando un Agilent 2100 Bioanalyzer secondo le istruzioni del produttore.

Rappresentante dei risultati:

Rendimenti isolamento RNA da diversi tessuti gamma di conifere 60-120 mcg / g tessuti congelati con i campioni legnosi tipicamente cedendo circa 70-80g / g di tessuto congelato. Rapporti di diagnostica di 260/280 e 260/230 sono entrambi di solito maggiore di 2.1, e sono buoni indicatori che il campione di RNA è priva di qualsiasi significativa fenoliche o contaminazione carboidrati, rispettivamente. I campioni analizzati mediante elettroforesi su gel seguita dalla colorazione EtBr dovrebbe mostrare tre fasce distinte per 25S, 18S e 5S RNA (Figura 1). Determinazione della stechiometria del 28S a 18S su gel di agarosio è un po 'soggettiva, e fattori quali condizioni di funzionamento per il gel, colorazione, e caricare campioni possono avere un effetto. In generale, il 28S: rapporto 18S appare essere> 1,5. Tuttavia, alcuni campioni di conifere hanno minore. Per esempio, a seguito di Agilent 2100 analisi abbiamo visto diversi casi di campioni di conifere da diversi tipi di tessuto in cui la stechiometria è più vicino a 1,2:1. Così, un apparente basso 28S: 18S stechiometria mediante elettroforesi su gel di agarosio non è necessariamente indice di scarsa qualità del campione. Foglia, sparare, e campioni di cono spesso avrà ulteriori bande distinte presenti a causa di cloroplastica RNA ribosomiale. EtBr macchiati di materiali che non migrare dal pozzetto o alto peso molecolare bande (> 8-10 kb) di solito indice di contaminazione di DNA genomico (Figura 2). A basso peso molecolare strisci in prossimità di o al di sotto della band 5S e ridotta colorazione banda ribosomiale 18S o un apparente> stechiometria 28S è un buon indicatore che la degradazione dell'RNA è verificato (Figura 3). Nell'analisi 2100 elettroferogramma Agilent, la linea di base deve essere bassa e relativamente liscia con picchi principali corrispondenti a 18S e 28S RNA ribosomiale 28S avere: rapporti 18S che vanno ovunque da 1.2 alla 2.0. L'integrità Agilent RNA Numero (RIN) valore può essere un migliore indicatore di qualità RNA e deve essere di almeno 7 o maggiore per RNA che deve essere utilizzato per la preparazione degli obiettivi microarray. La Figura 4 mostra una tipica Agilent 2100 elettroferogramma per RNA xilema con un 28S: rapporto 18S pari a 1,4 e un valore RIN di 8,6 mentre la Figura 5 mostra una xilema povero RNA avere una preparazione di base molto alta e il degrado evidente come rivelato dal 28S: 18S rapari a 0,65 e un valore di 3,4 RIN Tio.

Figura 1. Agarosio analisi gel di alta qualità RNA pino. Corsia 1, NEB 1 KB standard, corsia 2 mostra un tipico totale isolamento di RNA da xilema loblolly pino secondarie con caratteristiche ribosomiale 28S, 18S e 5S bande e apparente 28S: rapporto 18S> 1.

Figura 2. Analisi gel agarosio di campioni di pino RNA contaminato da DNA genomico. Corsia 1, NEB 1 KB standard, Lane 2, xilema campione di RNA che mostra la contaminazione di DNA genomico.

Figura 3. Gel di agarosio analisi del campione di pino che mostra la degradazione dell'RNA e la contaminazione con il DNA genomico. Corsia 1, NEB 1 KB standard, Lane2, xilema campione di RNA che mostra la contaminazione di DNA genomico e grave degradazione dell'RNA.

Figura 4. Agilent 2100 elettroferogramma di RNA totale xilema isolato con il metodo descritto su xilema loblolly pino. 28S: rapporto 18S è uguale a 1,4, valore uguale a 8,6 RIN

Figura 5. Agilent 2100 elettroferogramma di RNA punta apicale totale mostrando grave degrado e contaminazione genomico. 28S: rapporto 18S è uguale a 0,65, valore uguale a 3,4 RIN

Ottenere di alta qualità RNA da specie di conifere può essere un compito difficile, visti gli elevati livelli di composti fenolici e polisaccaride che si trova nei tessuti legnosi. A partire dal protocollo sviluppato da Chang et al. (1), abbiamo trovato che l'estrazione più rigorosa e ripulire gradini conducono all'isolamento coerente di altissima qualità RNA totale da woody diversi e non-tessuti legnosi campionato da una grande varietà di specie di conifere. Questo video ha dimostrato non solo il nostro protocollo di isolamento del RNA modificato, ma anche le misure adottate nel campo di raccolta e tecniche di lavorazione utilizzate per pino loblolly prima di RNA isolamento. Questi punti di raccolta e di preparazione sono ugualmente importanti per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA in campo raccolto campioni, così come per aumentare sia la qualità dell'RNA e la resa totale. Più significativo, abbiamo scoperto che l'RNA preparato con questo metodo ha portato ad un aumento dei rendimenti sintesi del DNA rispetto ad altri metodi utilizzati per preparare obiettivi microarray per l'ibridazione contro il loblolly PtGen2 pino microarray (2).