Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

1. Embriyonik sıçan dorsal spinal kord diseksiyonu

Genel öneriler

L-15 orta boy buz üzerinde tutun ve sık sık diseksiyonu çanak orta embriyoların serin tutmak için. Bu doku bütünlüğünü korumaya yardımcı olur. Belirtilmediği sürece tüm adımları Dumont # 5 forseps iki çift ile yapılır. Kontaminasyonu engellemek için,% 70 etanol ile tüm araçlar ve çalışma yüzeylerinde sprey ve diseksiyon orta şişe kapalı tutmak. Yemekler arasında embriyolar transfer etmek için, bir kesim plastik pipet veya delikli bir kaşık kullanın. Diseksiyonu başarıyla tamamlamak için omurilik (germe, nick) zarar görmemesi için kritik öneme sahiptir.

Hazırlık

• Soğuk L-15 orta
• L-15 50 ml +% 10 ısı ile inaktive edilmiş at serumu (HiHS). Buz üzerinde tutun.

Omurilik diseksiyonu

1. Euthanize E13 gebelik aşamalı sıçan (E0 = çiftleşme gün sonra ilk gün) kurumsal kurallarına göre CO ₂ odalı.
2. Karın% 70 etanol Sprey. Cerrahi makas ile forseps ve kesme alt karın bölgesi, cilt sıkın ve yukarı çekin. Karın boşluğuna ulaşmak için kas ve peritoneal katmanları üzerinden kesmek için tekrarlayın. Toraks, karın kenarlarında doku kesme bir V şeklinde kesi oluşturun. Asansör ve karın boşluğuna maruz doku geri çekin.
3. Rahim üç yerde bağlı olduğu alt merkezi karın ve her iki üst lateral köşelerinde. Embriyonik keseler arasındaki doku üzerinde kapma rahim kaldırın. Bağ dokusu, rahim ve buz üzerinde L-15 ile dolu bir Petri kabındaki kaldırmak için kesin.
4. Sonraki adımları bir diseksiyon mikroskop altında yapılır. Extraembryonic doku ve embriyonik membranlar bir embriyo ayırmak için, bir çift forseps ile rahim keseler arasındaki doku kapmak. Diğer çifti ile, yüzeysel membranlar (karanlık tarafı plasenta) yoluyla kesmek için kesenin daha şeffaf yan tutam. Embriyo kesesinin plasenta tarafında hafifçe basarak sıkın. Buz üzerinde L-15 ile doldurulmuş bir Petri kabındaki bütün embriyolar ve yer çıkarın.
5. Buz gibi L-15 ile doldurulmuş 10 cm Petri kabı yerleştirin, tek bir embriyo. Microscissors kullanarak, şekil 1a gösterilen açıda baş ve arka parçalar kesip.
   
   Bu açıda kesme pozisyonu embriyo "aşağı ventral yüzü" yerleştirilmesini yardımcı olacaktır.
   
   
6. Pozisyon embriyo "ventral yüzü aşağı" (anterior yere dönük, deneyci doğru işaret posterior) (Şekil 1b).
7. (Şekil 1c) embriyo "aşağı pin" forsepsi kullanarak, bir taraftan embriyo sıkıca tutun. Doku gözyaşı gibi, forseps hareket ettirmeyin. Forseps diğer çifti, deri soyulabilir "tutma" forseps (Şekil 1d-e) arasındaki bölgede başlayan embriyonun arkasına kapsayan. Bu, bu noktada, membranlar (meninksler) tarafından sarılmış, omurilik gösterecektir.
   
   Taraftan deri omurilik üzerinde değil, omurilik nicklemek önlemek için tut.
   
   
8. Kısmen omurilik (Şekil 1f) sağ tarafında doku ayırın. Holding forseps düzeyinde başlayarak, omurilik mümkün olduğu kadar yakın, kapalı forseps ile doku karıştırmak. Sonra yavaş yavaş, doku gözyaşı forseps açık. Bu, omurilik dorsal kök gangliyon (DRG) ayırmak gerekir ve ventral organları engel olmamalıdır. Böylece sonraki adım sırasında yukarı doğru çekilerek önlenmesi, bağlı bırakmak doku, embriyo ağırlık katan ön ve arka ucunda bağlı bazı doku bırakın. Buna ek olarak, bu doku, sonraki adımlarda embriyo üzerinde tutmak için kullanılır .
9. Ön ucundan başlayarak, meninksler kesme ve roofplate (Şekil 1g) boyunca omurilik açmak için kanca şeklinde tungsten iğne kullanın.
10. Embriyo 180 derece (posterior anterior deneyci dönük uzakta, işaret) (Şekil 1s) döndürün.
    
    Bu deneyci embriyonun diğer taraftan doku ayırmak için aynı eli kullanmanıza olanak sağlar.
    
    
11. Daha önce müstakil yüzüne kapma embriyo tutun ve (bakınız 1.8.) Aynı yöntemi kullanarak diğer taraftan doku bozabilir. Bittiğinde, omuriliğin her iki tarafta doku tamamen ayırın.
    Alternatif: Tamamen sol tarafında kalan doku ayırmak, ancak sağ taraftaki ön ve arka sonunda eklenen bazı doku bırakın. Bu bazen adım 1.12 pozisyonda spinal kord korumaya yardımcı olabilir.
12. Yan omurilik yerleştirin ve kalan mezenkimal doku ve DRG'ler çoğu (Şekil 1i) kaldırmak.
13. Bu aşamada, beyincik ve omurilik birbiri üzerine apposed doku iki "levha". Spinal kor menenjlerin kısa bir bölümü kapalı, büyük, en ön-omurilik kısmı ve kabuğu aşağı pind (Şekil 1j, sol). Şimdi, forseps ile arasında kapma ayrılmış iki segmentleri tutun ve bir düz, sabit bir hareketi (Şekil 1j) ile meninksler soyulabilir.
    Eşitsiz omurilik ve / veya meninksler katmanı kırılmaya yol açacaktır "soyma". Hala meninksler bağlı omurilik kısmını kurtarmak için genellikle mümkün değildir.
14. Plastik bir pipet kullanarak, L-15 +% 10 HiHS içeren Petri izole spinal kord transferi ve buz üzerinde bırakın. Tipik olarak, tüm embriyoların omurilik dorsal kısımlarını diseksiyon önce toplanır.

Dorsal omurilik diseksiyonu

15. L-15 +10% HiHS içeren bir "açık-kitap" yapılandırma düz yalan bir Petri kabındaki bir omurilik. Kesip daha geniş, ön kısmı (Beyin parçası içerir) (Şekil 1k).
16. Dorsal dokusunun omurilik (incir 1l, sol) en lateral kısımlarında yer almaktadır. , Genişliği yarım omurilik 1/5th bir şerit, düz bir tungsten iğne ile kablosu bağlantılarını kesmek için L-şekilli tungsten iğne kullanın. (Şekil 1l, sağ). 15 ml plastik tüp buz üzerinde L-15 +% 10 HiHS içeren bir sırt şeritleri yerleştirin.
    ~ 12 E13 embriyoların dorsal nöral tüp bölümlerini disosiasyon sonra kaplama için ~ 3.5-4 milyon hücre verecektir. Dorsal spinal kord (geniş dorsal şeritler kesme) bir kaba diseksiyonu yaparak daha fazla hücre elde edilebilir, ancak commissural nöron saflık azalacaktır.

2. Commissural nöron kültürü

Genel öneriler

Tüm adımları, aksi belirtilmedikçe, doku kültürü kaputu steril koşullar altında yapılmalıdır . Taze orta ve taze çözülmüş takviyeleri ve reaktifler kullanın. Bölünmeler ve ezerek toz haline getirme adımları Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} Ca ² en aza indirmek için ücretsiz HBSS ⁺ / Mg ^{2 +} bağımlı adezyon yapılmaktadır.

Hazırlık

• kaplamalı lamelleri (Alman Desag cam kullanmak) veya doku kültürü levhalar (aşağıda kaplama yordama bakın).
• sıcak Neurobasal Kaplama Medya (aşağıya bakın), doku kültürü yemekleri ve kaplama önce en az 1.5 saat süreyle doku kültürü inkübatörde ₂ dengelenmiş CO.
• 37 ° C su banyosunda% 2.5 tripsin
• 2 şişe HBSS Ca ^{2 +} Mg / ^{2 +} ücretsiz, 4 ° C, az bir 37 ° C.
• iki yangın parlatılmış cam Pasteur çapı yarım olağan boyutta ve yarısından biraz daha küçük bir çapa ile bir pipetler. Sterilize Pasteur pipetler kullanın. Pipetler ateş-lehçe için, çapı biraz azaltmak için ucu eritmek için (açık mavi alev üst) Bunsen beki kullanın. Bu adımı doku kültürü kaputu dışında olduğundan, doku kültürü kaputun altında yerleştirmeden önce% 70 etanol ile pipetler spreyi. Nöronlar, mont, başlamadan önce sadece öğütme adım önce ayrışma veya (pipetler medya ile doldurun ve 30 saniye boyunca tutun) içeren serum medya ile Pasteur pipetler daha verimli geri almak için Bu hücreleri öğütme sırasında Pasteur pipeti içine yapışmasını önleyecektir.
• PLL kaplı yemekleri veya lamelleri yıkamak için steril milliQ su
• HBSS% 12.5 MgSO ₄ çözüm

Poli-L-lisin kaplama

Cam lamelleri, 24 saat boyunca asit yıkama ve kaplama (bkz. Kaech ve Banker, 2006) önce sterilize kullanıyorsanız. Alman Desag cam lamelleri kullanın.

Kat, cam lamelleri ya da plastik doku kültürü yemekleri poli-L-lizin:

• bir doku kültürü kaputu altında, 1,75-2 saat için 100 ug / ml PLL çözüm küçük bir kubbe ile yüzeyleri kapsar.
• milliQ su, yıkama başına en az 5 dakika (aşağıda hücre disosiasyon adım sırasında yapılabilir) ile iki kez yıkayın.
• kullanımı kadar su saklayın. PLL kaplı yüzeyi kuru izin vermeyin.
  Lamelleri kaplama için PLL israfını azaltmak için, bakteri steril Petri yemekler lamelleri yerleştirin. Coat ve lamelleri üzerinde sıvı bir kubbe yerleştirerek lamelleri yıkayın. Bakteriyel Petri yemekler hidrofobik, bu nedenle sıvı cam lamelleri kalmalıdır. Hücrelerin sadece kaplama önce doku kültürü yemekleri lamelleri aktarın.
  Plastik doku kültürü yemekleri kaplama nöronlar için, yapışma, normalde daha yüksek, dolayısıyla neurite uzama azalmış olabilir.

Bölünmeler ve kaplama

1. Dorsal şeritler tüpün dibine yerleşmiş olduğunu kontrol edin. Pasteur pipeti ile L-15 +10% HiHS en çıkarın. Hızlı soğuk (4 ° C) HBSS 3 ml ekleyerek, bir kez dorsal nöral tüp şeritler yıkayın.
2. Dorsal nöral tüp şeritleri 2 dakika dinlendiriniz, daha sonra Pasteur pipeti ile HBSS çıkarın.
3. 4.7 ml bir birime sıcak (37 ° C) HBSS ekleyin. Then% 0.15 tripsin son bir konsantrasyon elde etmek için 0.3 ml% 2.5 tripsin ekleyin.
4. 37 ° C'de 7 dakika süreyle su banyosunda inkübe edin. Kuluçka yoluyla kez yarı yolda hafifçe karıştırın.
5. 150 U / mL son konsantrasyon için 30 ul DNAz (25 000 U / ml) ekleyin. 60 ul MgSO ₄ ekleyin ve son bir konsantrasyon için% 0,15, kısaca karıştırın.
   Için 37 ekstra 1 dakika boyunca inkübe kaba diseksiyonları doku ° C su banyosunda.
   
   Bu aşamada, dorsal nöral tüp bölümleri parçalanmış olmalıdır. Dorsal nöral tüp bölümler parçalanmaya başlamış yoksa, genellikle% 2.5 tripsin stok eski olduğu anlamına gelir ve yeni hisse senedi çözülmüş olmalıdır, ya da soğuk HBSS yıkama etkili örnek HiHS kaldırmak vermedi .
6. 4 dakika için 200 g doku parçaları santrifüjleyin.
7. Tüpün alt kısmında yaklaşık 50-100 ul sıvı bırakarak, Pasteur pipeti ile süpernatantı.
8. Pelet gevşetmek için tüp hafifçe Flick, sonra 5 ml sıcak HBSS ekleyerek hücrelerin yıkayın. Oda sıcaklığında 2 dakika dinlendiriniz.
9. 5 dakika için 200 gr santrifüjleyin.
10. Tüpün alt kısmında yaklaşık 50-100 ul sıvı bırakarak, Pasteur pipeti ile süpernatantı.
11. Tüp yavaşça pelet gevşetin ve kısmen hücreleri tekrar süspansiyon Flick. Daha sonra 2 ml sıcak HBSS ekleyin.
12. Küçük (yarı çap) yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti hücreleri yavaş yavaş 4-6 kez ve aşağı yukarı pipetleme ayırmak. Kabarcıkları yapmaktan kaçının ve tüpün kenarına sıvı pipetle. Aşırı çiğnemek etmeyin.
13. Yavaş yavaş 3-4 kez ve aşağı yukarı pipetleme hücreleri ayırmak küçük yangın parlatılmış cam Pasteur pipet kullanın. Kabarcıkları yapmaktan kaçının ve tüpün kenarına sıvı pipetle. Aşırı çiğnemek etmeyin.
    Kaba diseksiyonları doku için, ayrışma sonunda tüpe 1 ml sıcak HBSS ekstra bir ekleyin.
    Hücrelerin dissociating, tüm hücre kümeleri ve agrega ayırmak gerekli değildir. Yukarı ve aşağı pipetleme durdurun ya da daha fazla pipetleme hücre agrega boyutu daha fazla azalma görürseniz küçük çaplı bir Pasteur pipeti .
14. Kalan herhangi bir doku parçaları tüp içinde 1 dakika dinlendiriniz. Bu hücreler yeni bir tüpe transfer için gerekli değildir.
15. 20 ul hücre süspansiyonu ve tripan mavi 5 ul ekleyin. Bir haemocytometer hücreleri saymak.
    Nöronlar tripan mavisi dışlama ≥% 95 uygulanabilir olmalıdır.
16. Neurobasal Kaplama Medya nöronların (aşağıya bakınız Tarifler) Levha.
    • Izole nöronların (düşük yoğunluklu kültürler birbiriyle örtüşen veya topaklanma nöronlar önlemek için) elde etmek için önerilen kaplama yoğunlukları:
    • 120 000 - 180 000 hücre / 6 plaka
    • 60 000 - 75 000 hücre / 12 plaka
17. 16-18 saat sonra, (aşağıda Tarifler) Neurobasal Büyüme Medya ortamı değiştirmek
    Medya değişen kültür çanak medya aspire bir vakum pompası kullanmayın; hafifçe bir pipet kullanın. Bu nöronlar yerinden oynatmamaya önler.

Temsilcisi Sonuçlar:

Dört saat sonra kaplama, nöronlar poli-L-lisin (PLL) kaplı yüzey uyulması gerekirdi. Faz kontrast aydınlatma altında, yapıştırılır hücre gövdeleri genellikle nispeten düz ve oval şekilli (Şekil 2a). Iyi yapışmış hücreler çanak tarafında çok hafifçe vurdu zaman hafifçe hareket küre gibi görünür. Birçok faktör potansiyel olarak (tartışma) hücre yapışmasını engelleyebilir.

In vitro olarak 30 saat sonra, en fazla nöron, gözle görülür bir büyüme konisi (Şekil 2c, d) bir akson genişletmiştir . Kötü aksonal büyüme görülürse Neurobasal Büyüme Medya taze orta ve besin takviyeleri ile yapılmış olduğunu doğrulayın. Nöronlar, bu koşullarda en az 6 gün süreyle sağlıklı kalır. Bu prosedür nöronlar ~% 90 DCC (Yam ve ark 2009) ifade ile, güvenilir, yüksek commissural nöronlarda zenginleştirilmiş hazırlıkları verim kanıtlamıştır. Hücre süspansiyonu hazırlamak için kullanılan dorsal spinal kord şerit genişliği, ince şeritler kullanılmaktadır daha fazla saflıkta, kültürünün saflığını etkileyecektir. Örnek bir uygulama Şekil 3 (immünofloresan) gösterilir. Yam ark makalesine bakın. Daha fazla örnek için (2009).

Şekil 1 omurilik diseksiyonu adımları Şemalar. D = Dorsal, V = Ventral daha büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2 izole commissural Temsilcisi sonucunöronlar bir PLL kaplı cam lamel kaplamalı. a, b) 4 saat sonra kaplama, nöronlar yüzeye yapıştırılır. Bar = 20 mikron. c, d) 30 saat sonra kaplama, nöronlar, gözle görülür bir büyüme koni ile bir akson uzatıldı. Bar = 20 mikron.

Şekil 3 commissural nöron Phalloidin (F-aktin, kırmızı) ve DAPI (mavi) çekirdeği etiketli F-aktin, gama-tubulin (yeşil) immunohistokimyasal.

Tarifler ve yorumlar

Neurobasal Kaplama Media

• Neurobasal
• % 10 Isı inaktive FBS (HiFBS)
• 2 mM L-glutamin (200 mM stok solüsyonu)
  İsteğe bağlı: Penisilin / Streptomisin antibiyotik (yarısı normal konsantrasyon kullanmak)

Neurobasal Büyüme Ortamı

• Neurobasal
• B27 (1 / 50 dilüsyon stok)
• 2 mM L-glutamin (200 mM stok solüsyonu)
• İsteğe bağlı: Penisilin / Streptomisin antibiyotik (yarısı normal konsantrasyon kullanmak)
  
  Medya yapıldıktan sonra, iki hafta süreyle 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Hücre, doku kültürü Petri kutularına medya ve doku kültürü inkübatör yer kaplama en az 1,5 saat önce, sıcaklık ve medya pH dengelenmesi için .

Neurobasal

Neurobasal orta bir şişe açıldıktan sonra, bir ay boyunca, 4 tutulmalıdır ° C karanlıkta. , Aksi halde hücre sağkalım daha düşük olacaktır bir aydan fazla açılmıştır Neurobasal atın.

Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (HiFBS) veya at serumu (HiHS)

56 ısı inaktive FBS veya HS, ısı ° C su banyosunda 30 dakika. Swirl şişe yaklaşık olarak her 10 dakika kadar. Isı-inaktive FBS çökeltileri temizlemek için santrifüj gerekebilir (doğruluk yerleştirin. Bu noktada zamanlama başlayın. Şişe su, 56 ° C ulaşıldığında görmek için bir termometre, su ile dolu benzer büyüklükteki bir şişe kullanın) ve -20 ° C'de aliquoted ve tekrar dondurulmuş olabilir

L-Glutamine

Her zaman her bir deney için L-glutamin taze bir kısım Çözülme.

B27

B27 Alikot 20 ° C Uzun süreli depolama ya da 4 ° C ile bir ay kadar saklanabilir.

Biz embriyonik sıçan omurilik commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem tanımlanmıştır. Bu prosedür, laboratuvarda rutin olarak güvenilir bir akson rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları çalışma nöronların hazırlamak için kullanılır olmuştur. Hücre biyolojisi ve immünokimyanın deneyler, bir çöp diseksiyonu için yeterli nöron üretir. Daha fazla hücreler ihtiyaç olduğunda, birçok biyokimya deneyler, iki litre diseksiyonu gibi gerekli olabilir. Eğitimli bir kişi için, teşrih ve ~ 20 embriyoların ayrılma az 4 saat içinde yapılabilir. Daha uzun zaman çizelgesi omurilik doku bütünlüğü değişiklikler nedeniyle daha zor bir diseksiyon neden olacaktır ve aynı zamanda etkili bir şekilde uygulanabilir nöronlar kurtarma tehlikeye sokabilir.

Ilk defa işlem yaparken, karşılaştırma için çeşitli PLL kaplı yüzeylerde plaka hücreleri (asitle yıkanmış cam lamelleri, doku kültürü yemekleri). Normalde, hücreler PLL kaplı plastik doku kültürü yemekleri ya da çok iyi plakaları sağlam eklemek gerekir. Cam lamelleri hücre adezyon ve büyüme ile ilgili sorunlar varsa, bu hücre canlılığı ve bakım için genel bir kontrol olarak kullanılabilir. Cam kötü hücre adezyon sorumlu ana faktör, cam ve kapak temizliği (asit yıkama ve sterilizasyon) kalitesi. Bu PLL kaplama etkinliğini azaltan kısmen hücre adezyon etkileyecektir. Diğer ortak faktörler kötü PLL-kaplama (kaplama çok kısa bir zaman ya da çok eski PLL çözüm), bakteri veya mantar kontaminasyonu veya medya veya eski veya süresi dolmuş olan takviyeleri kullanılması sayılabilir.

Biz, immünokimyanın, biyokimya, tornalama ve deneyleri (Yam ve ark 2009) deneyler de dahil olmak üzere, çeşitli tip bu prosedüre göre hazırlanmıştır commissural nöron kültürleri var. Enteresandır ki, PLL kaplı cam kaplama commissural nöronlar, rehberlik ipuçları cevap vermek için yani, Sonic Hedgehog gibi uygulamalı bir chemotropic faktörü, tepki büyüme yönünü değiştirmek, daha önce bir akson rehberlik işaret (gösterilmiştir yeteneğini muhafaza Charron ve ark, 2003; Okada ve ark, 2006; Yam ve ark 2009; Fabre ve ark, 2010). Bu nedenle, bu, in vitro akson rehberlik ipuçlarının etkisini araştırmak için güçlü bir sistem ve in vivo olarak mümkün değildir deneyler için izin verir.