מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

1. המצאה של אדונים סיליקון באמצעות photolithography סטנדרטי SU-8 ¹ (לא רואים בסרט הזה).

1. השתמש תקן SU-8 שיטות photolithography ליצור SU-8 "אמן" (SU-8 2025, MicroChem, ניוטון, MA) בודה את התבנית PDMS המכיל את רשת microfluidic קאמרית chemotaxis. תבניות הורים כאלה יכולים להיות מפוברק בכל מתקן microfabrication (למשל, סטנפורד מיקרופלואידיקה יציקה; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. לפני שכפול PDMS, לחשוף את SU-8 המאסטר אדי fluorosilane בתוך תא ייבוש המחובר למקור ואקום כדי להקל על שחרור קל של PDMS מן האדון. הוסף ירידה של fluorosilane על מגבת נייר וליישם ואקום דקות אחד. הסר את האבק ולאפשר 30 דקות עבור בתצהיר של fluorosilane. שמור את המאסטר SU-8 בכלי סגור לשימוש עתידי.

2. דפוס Replica של PDMS ממורה SU-8: שכבת fluidic ואת השכבה מלאה מיוצרים על ידי דפוס העתק של PDMS ממורה SU-8.

1. מערבבים את PDMS מראש פולימר צולבות מקשר ב wt 10:01. יחס דגה ב dessicator במשך שעה 1 (או עד בועות אוויר יוסרו מן התערובת PDMS).
2. מניחים את המאסטר SU-8 בצלחת פטרי ובזהירות לשפוך את התערובת PDMS על גבי יחידת SU-8 בעובי הרצוי.
3. מחממים את צלחת פטרי שמכילה את PDMS ואת SU-8 עובש אמן 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לרפא את PDMS.
4. הסר את נרפא PDMS מכוסה SU-8 הורים מתוך פלטה חשמלית לבין קליפת עובש PDMS מן האב SU-8. המבנה הרצוי יהיה מוטבע עובש PDMS.
5. קודח חורים עובש PDMS עבור צינורות אל הגנרטור שיפוע כניסת התא באמצעות 20 מד בוטה לקצה המחט.

3. Bonding PDMS של מכשירים:

1. נקה מיקרוסקופ זכוכית שקופית עם isopropanol ויבש עם חנקן או זרם אוויר.
2. לחשוף את PDMS והחלק הזכוכית פלזמה חמצן אשר פלזמה.
3. מביאים את התבנית PDMS במגע עם שקופיות הזכוכית. מחממים את השקופית קשר עם עובש PDMS עד 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

4. הרכבת המכשיר PDMS

1. באמצעות סכין גילוח, לחתוך צינורות ב 45 ° זווית באורך הנכון הנדרש עבור המכשיר.
2. הכנס קצה אחד של הצינור לתוך החורים אגרוף המכשיר (למשל, שקע) באמצעות מלקחיים.
3. בעזרת מלקחיים, להכניס מחט קהה 30-מד אל הקצה השני של הצינור.
4. חזור על שלב 4.2 עבור כל החורים שנותרו.
5. איסוף 1mL של chemotaxis חיץ (CB) בתוך מזרק 3mL, מקפיד להסיר בועות אוויר מן המזרק.
6. תקן רכזת המחט בקצה אחד של הצינור לשקע.
7. הוסף CB לרכזת את המחט, והקש הרכזת מחט כדי להסיר בועות אוויר.
8. תלחצי קצת לא CB של קצה המזרק וחבר את המזרק 3mL לרכזת את המחט ללא השמנה האוויר.
9. Push CB דרך המכשיר עד שכל רכזות מחט הנותרים מלאים עם CB. זה אמור להסיר את רוב בועות אוויר.
10. מילוי שני מזרקים 500μL עם CB המכיל ריכוזי המתאימה של chemoeffector נבדק. מנע היווצרות בועת אוויר על ידי לחיצה על ירידה קטנה של תכולת המזרק נוגע טיפה לנוזל ב לרכזת את המחט מצרף.
11. כמו כן, לחבר מזרק המכיל CB אל כניסת חיידקים. זו תוסר כאשר החיידקים מוחדרים לתוך המכשיר.

5. צמיחה של E. ניעתי מאוד coli

1. לגדול תרבויות לילה של E. coli RP437 עם הבעה GFP פלסמיד ב 20 מ"ל של tryptone מרק (TB) בשעה 32 ° C עם רעד. הוסף בריכוז המתאים של אנטיביוטיקה כדי לשמור על פלסמיד. בפרוטוקול שלנו, אנו משתמשים נמוכה להעתיק pCM182 פלסמיד לאיתור חיידקים מבוסס על הקרינה במכשיר. עבור א coli, תרבויות גדל ב 32 ° C מומלצת תנועתיות גבוהה, כמו תנועתיות נמוכה בטמפרטורות גבוהות.
2. השתמש תרבות לילה לחסן תרבות 20 מ"ל של שחפת בקבוק 250 מ"ל Erlenmeyer צפיפות אופטית ב 600nm של ~ 0.05. לגדול עם התרבות רועד ב 32 ° C.
3. קציר התאים ב OD של ₆₀₀ ~ 0.35 0.45 על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ב XG 400 דקות 5.
4. Resuspend התאים OD של ₆₀₀ ~ 0.35 ב CB המכיל את chemoeffector בריכוז הצפוי באמצע הערוץ.
5. הוסף RFP שכותרתו תאים מתים על OD של ₆₀₀ ~ 0.35 ל-GFP להביע תאים חיים. המתים (אדום) התאים משמשים בקרה פנימית על מנת להבטיח כי כל הגירה היא לא בשל תופעות זרימה.

6. ניטור chemotaxis

1. הסר כמה מן CB המחט כניסת תאהרכזת. מילוי עם ההשעיה התא.
2. למלא בעדינות את המזרק 50μL עם התאים resuspended. צעד זה צריך להיעשות לאט כמו שוטונים יכול להיות טעון ו תפחית תנועתיות.
3. צרף את המזרק 50μL לרכזת כניסת המחט, כפי שמתואר בשלב צעדים 4.10.
4. מקם את המכשיר על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמה במהירות גבוהה לרכישת התמונה. מניחים את כניסת מזרקים (גם 500 מזרקים שיפוע μL ואת מזרק 50 תא μL) לתוך המשאבה מזרק וליזום תזרים כזה שיפוע נוצר ותאי זורמים דרך הצינור.
5. לאחר התאים להיכנס לחדר chemotaxis, לחכות ~ 20 דקות עבור מערכת לייצוב לפני הדמיה.
6. איסוף ירוק (חי) ואדום (מת) תמונות הקרינה במקומות שונים לאורך החדר (המקביל ל בזמנים חשיפה שונה). בדרך כלל, אנו אוספים 100 תמונות במיקום אחד ב 3 שניות במרווחים.

7. ניתוח נתונים: השלבים הבאים ניתן לבצע באמצעות ניתוח כלשהו זמין מסחרית תמונה התוכנית (למשל, ImageJ, Metamorph) או באמצעות קודי פשוט כתוב ב-Matlab.

1. הסר את הרקע פיקסלים בתמונה (כלומר, סף לקבוע עוצמת פיקסל ולהסיר את כל פיקסלים כי יש אינטנסיביות פחות מ סף). זה רעש ממזער בניתוח.
2. השתמש את המיקום של התאים המתים (אדום פלואורסצנטי) כדי לקבוע את מרכז התמונה. מאז תאים מתים להראות שום chemotaxis, זה מייצג את העמדה שבה תאים נכנסו לחדר chemotaxis ויהיה מזוהה בהעדר כל הגירה.
3. איתור תאים חיים (פלואורסצנטי ירוק) בתמונה.
4. מחלקים את התמונה לתוך ערוצים לקבוע את מספר תאים חיים בכל ערוץ. בשנת העבודה הקודמת שלנו ^3, 1050 הרחב מיקרומטר chemotaxis קאמרית חולקה 64 ערוצים, כי הם כל ~ 16 מיקרומטר רחב.
5. חזור על שלבים 7.1 7.3 לתמונות כל סכום ספירת תאים הכולל לכל ערוץ לאורך כל התמונות. זה נותן את מספר התא הכולל זוהה על כל ערוץ במשך כל תקופת הניסוי.
6. חשב את מקדם החלוקה chemotaxis (CPC), המייצגת את כיוון הנדידה, כדלקמן: כל תא הממוקם בריכוז גבוה (מימין) וריכוז נמוך (משמאל) צידי תאים מתים מוקצה מכפיל של 1 ו -1 , בהתאמה. כלומר, תא נודד במעלה שיפוע מוכפל 1 בעוד התאים נע לאורך שיפוע מוכפלים ב -1. כל הערכים כפול מתווספים מעלה מנורמל למספר הכולל של תאים זוהה. לדוגמה, ערך עלות לקליק של 0.40 עולה כי 40% יותר חיידקים סך עבר לצד ריכוז גבוה מאשר בצד ריכוז נמוך (כלומר, chemoeffector מהווה attractant כמו חיידקים יותר התגלו נעה במעלה מדרון).
7. לחשב את מקדם ההגירה chemotaxis (CMC), אשר שוקל את ההגירה של תאים על ידי המרחק נסע, כדלקמן: תא משקל לספור בכל ערוץ בפקטור כי הוא יחסי למרחק כי תאים נודדים. תא שזז לתפקיד ריכוז גבוה הרחוק (ערוץ 64) ניתנת גורם הניפוח של 1, ואילו אחד שזז לאמצע לצד ריכוז גבוה ניתנת גורם הניפוח של 0.5, ו - תא שעבר הרחוקה ביותר ריכוז נמוך המיקום משוקלל -1. לסכם את כל ספירת תא משוקלל לנרמל למספר תאים כדי להפיק את CMC.

נציג תוצאות ^3,4:

השתמשנו במכשיר microfluidic (איור 1A) המתואר כאן לחקור chemotaxis של E. coli ב הדרגתיים של משיכה (חומצה אספרטית, autoinducer-2) ו דוחי (NiSO _4, אינדול) ^3,4. אבטיפוס chemotaxis ⁵ זן E. coli RP437-GFP להביע שימש, יחד עם kanamycin-נהרגה E. coli TG1 תאים לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום כדי לפקח על תופעות זרימה. שיפוע הריכוז נוצרו המכשיר μFlow מוצג בתרשים 1B. כניסת התא היה כתרים כך שאין לזרום דרך אותו שיפוע יציב של 0 100 ng / mL של fluoresscein הוקמה בשנת המכשיר. עוצמת פיקסלים לרוחב המכשיר היה בשימוש כדי לקבוע את פרופיל ריכוז והעמסת. הנתונים מראים כי חיידקים המפגש שיפוע ליניארית כשהם נכנסים לחדר chemotaxis. 2A ו-B באיור מראה תמונות הקרינה של ה RP437 coli נודדות בתגובה הדרגתיים של חומצה אספרטית (0 100 מיקרומטר) ו NiSO ₄ (0 225 מיקרומטר). התגובות שנצפו attractant אלה הקנונית ודוחה הם כצפוי. 3A איור מציג את התפלגות לכמת של E. coli RP437 בהעדר מפל ריכוזים (כלומר, שיפוע null של חומצה אספרטית), בעודאיורים 3 ב ו - ג המופע הפצה הדרגתיים של חומצה אספרטית ו NiSO _4. הספציפיות של התגובות הללו (כלומר, הטיה הגירה) בולטת כמו E. coli RP437 Δ זפת זן (כלומר, מאמץ חסר chemoreceptor טאר המשמש החיידק לחוש חומצה אספרטית ניקל ו) אין להדגים את הטיה הגירה בנוכחות מפל ריכוזים של חומצה אספרטית או NiSO _4. המגמות ניכרת את הפרופילים הפריסה המרחבית גם בקנה אחד עם ערכי על"ל מחושב CMC. לקליק ערכי הגירה של E. coli RP437 ב הדרגתיים של חומצה אספרטית או NiSO ₄ הן 0.33 ו -0.33, בהתאמה. הערכים המתאימים CMC הן 0.13 ו -0.14, בהתאמה. לעומת זאת, עלות לקליק CMC ערכים עם E. RP437 coli Δ זן הזפת הדרגתיים של חומצה אספרטית או NiSO ₄ זניחים. בנוסף, עלות לקליק CMC ב שיפוע ריק של חומצה אספרטית הן 0.03 ו - 0.02, בהתאמה, מעידים על חוסר הטיה הגירה בהעדר צבע.

באיור 1. התקן סכמטית ואת שיפוע הריכוז.
(א) ייצוג סכמטי של המכשיר chemotaxis microfluidic. המכשיר מורכב מודול שיפוע, ערבוב (20 x 100 x 18,750 מיקרומטר) ואת מודול תצפית chemotaxis (20 x 1,050 x 11,500 מיקרומטר). רוחב של שני ערוצי צבע הזנת המכשיר הן 500 מיקרומטר ו רוחב של כניסת חיידקים הוא 50 מיקרומטר. הבלעה מתארת ​​שיפוע של מולקולת האיתות (אפור) חיידקים נודדים בעקבות זאת. חיידקים חיים מתוארים אליפסות מוצק, ואילו החיידקים מתים מוצגים אליפסות פתוח. (ב) מפל ריכוזים בין 0 ל 100 ng / mL והעמסת נוצר המכשיר צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונות Fluorescence נרכשו לאחר 30 דקות ו לכמת ידי ניתוח התמונה.

איור 2. Chemotaxis של E. coli RP437 במכשיר microfluidic.
E. coli RP437 נחשף שיפוע של (A) L-000-100 מיקרומטר aspartate או (ב) 0-225 מיקרומטר NiSO ₄ במכשיר ואת נדידת חיידקים חיים (ירוק) כלפי aspartate-L או הרחק ניקל צילמו כל 2.5 שניות למשך 30 דקות. חיידקים המלח (אדום) שימש לשלוט על ההשפעות תזרים במכשיר. תמונות היו לכמת באמצעות in-house פיתחה ניתוח program3. הנתונים המוצגים הם נציג פסאודו בצבע תמונות מתוך שלושה ניסויים עצמאיים.

איור 3: כימות פרופילים ההגירה attractant קנוני ודוחה.
הפריסה המרחבית של RP437 במכשיר microfluidic בתגובה (א) אחיד 100 מיקרומטר L-aspartate (כלומר, ללא שיפוע), (B) 0 100 מיקרומטר שיפוע של aspartate, ו - (ג) 0 225 מיקרומטר שיפוע של NiSO ₄ . חלוקת תאים מתים מוצג כקו יציב, חלוקת תאים RP437 מוצג כקו מקווקו, ועל חלוקת תאים RP437 EDA ⁺ Δ זפת מוצג כקו מקווקו. הנתונים המוצגים הם ממוצעים של שלושה ניסויים עצמאיים.

מקדם החלוקה chemotaxis (CPC) ואת מקדם ההגירה chemotaxis (CMC) יכול להיות מחושב כפי שמתואר מאו ואח' ^5. אם תא מזוהה בצד ריכוז גבוה, הוא מקבל ערך של 1, ואילו תא זוהה בצד ריכוז נמוך ניתנת ערך של -1. הערכים סיכם ואמר מחולק במספר הכולל של תאים כדי להפיק את העלות. הסימן של עלות לקליק (חיובי או שלילי) נותן את הכיוון של הגירה (לכיוון או הרחק אות). למרות העלות מציין אם התאים מגיבים כימיים כמו attractant או דוחה, זה לא לכמת את מידת chemotaxis. לשם כך, אנו לחשב את CMC על ידי חלוקת פרופיל הפריסה המרחבית של חיידקים לרוחב המכשיר תוך 64 חלקים (32 בכל צד של כניסת התא), וכן הקצאת שקלול גורם לתאים כל קטע מבוסס על מרחק של הגירה. סעיפים הרחוקה מהמרכז (סעיפים 1 ו 64) מוכפלים 1 (= 31.5/31.5) או -1 מאחר שהם מכילים תאים היגרו המרחק המקסימלי. הבא שני סעיפים (2 ו 63) מוכפלים 0.968 (= 30.5/31.5) או -0.968. האחרון שני חלקים (כלומר, 32 ו - 33 כי הם הקרובים ביותר כניסת התא) מוכפלים + 0.015 (= 0.5/31.5) או -0.015. הערכים משוקלל מסוכמים ו מנורמל למספר הכולל של תאים כדי להפיק את CMC. CMC של 1 עולה כי כל החיידקים עברו לגמרי השיפוע אל הקיר של החדר לזרום. במקרה של תגובה אטרקטיבי קלה, CMC עדיין יהיה חיובי, אך יש ערך קטן יותר, בעוד הערך לקליק עדיין יהיה 1. לפיכך CMC מפלה התאים מגיבים מבוסס על היקף ההגירה.

פרמטרים מסוימים צריך להיות מבוקר בקפידה תוך ביצוע ניסויים chemotaxis. הטמפרטורה שבה חיידקים מעובדות חשוב. עבור א coli, ראינו כי הטמפרטורה הצמיחה הטובה ביותר היא 32 מעלות צלזיוס בטמפרטורות גבוהות להפחית תנועתיות. עבור קולטנים מסוימים להיות נוכחים חיידקים, ייתכן שיהיה צורך לגדל את החיידקים בנוכחות גרימת chemoeffector (כלומר, ממשלה התאים עבור chemotaxis). לדוגמה, כאשר חוקרים את התגובה של חיידקים מלטוז, התאים גדלים עם 0.1% (w / v) של הסוכר. כאשר resuspending את החיידקים לאחר צנטריפוגה, חשוב כי עדין רועד / גלגול של הצינור מבוצעת והתאים אינם vortexed. רועד נמרץ יכול גזירה שוטונים ולהפחית את תנועתיות של תאים נבדק. ספיקות בשימוש המכשיר יהיה צורך נקבע על בסיס תנועתיות של החיידק נבדק. שיעורי הזרימה איטית יותר עשוי להידרש חיידקים, כי הם פחות ניעתי, וקצב הזרימה האופטימלית צריכה להיקבע באופן אמפירי.

אנו צופים כי המכשיר μFlow יכול לשמש יסוד חקירות על chemotaxis חיידקי (למשל, תחרות בין chemoeffectors עבור קולטן אותו), כמו גם בזיהוי חיידקים דגימות סביבתיות המגיבים כימיקלים מסוימים כמו משיכה או דחייה.