Ett mikroflödessystem enhet för att kvantifiera Bakteriella chemotaxis i stabila koncentrationsgradienter

1. Tillverkning av kisel mästare med standard SU-8 fotolitografi ¹ (visas inte i denna video).

1. Använd standard SU-8 fotolitografiska metoder för att skapa en SU-8 "master" (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) för att tillverka de PDMS mögel som innehåller mikroflödessystem nätverket och chemotaxis kammare. Sådan herre formar kan tillverkas i alla mikrofabrikation anläggning (t ex Stanford Mikrofluidik Foundry, http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. Före PDMS replikering, utsätta SU-8 mästare till fluorosilane ånga i en exsickator bifogas ett vakuum källa för att underlätta enkel frisättning av PDMS från master. Tillsätt en droppe fluorosilane till en pappershandduk och ansöka vakuum för en min. Ta bort vakuum och tillåter 30 min för deponering av fluorosilane. Håll SU-8 mästare i en sluten behållare för framtida bruk.

2. Replika gjutning av PDMS från SU-8 mästare: De fluidic lager och kontroll lagret görs av replica gjutning av PDMS från SU-8 master.

1. Blanda PDMS pre-polymer och cross-länkare på 10:01 WT. förhållandet och lufta i en exsickator under 1 timme (eller tills luftbubblor avlägsnas från PDMS blandning).
2. Placera SU-8 mästare i en petriskål och försiktigt häll PDMS blandningen ovanpå SU-8 mästare till önskad tjocklek.
3. Värm upp petriskål innehåller PDMS och SU-8 mästare mögel vid 80 ° C i två timmar för att bota PDMS.
4. Ta bort härdat PDMS-täckt SU-8 mästare från kokplattan och skala PDMS mögel från SU-8 master. Den önskade strukturen kommer att bäddas in i PDMS mögel.
5. Punch hål i PDMS mögel för slangen till lutning generatorn och cell inloppet med en 20 gauge trubbig slut nål.

3. Limning av PDMS enheter:

1. Rengör en bild glas mikroskop med isopropanol och torka med kväve eller en luftström.
2. Exponera PDMS och glasskiva till syre plasma i en plasma Asher.
3. Ta med PDMS mögel i kontakt med glasplatta. Värm kontaktade bilden och PDMS mögel till 65 ° C i 15 min.

4. Montering av PDMS-enheten

1. Använda ett rakblad, skär slangar i 45 ° vinkel till rätt längd som är nödvändig för enheten.
2. Sätt i ena änden av slangen i hålen stansas i enheten (t.ex. uttag) med hjälp av pincett.
3. Använd pincett in en trubbig 30-gauge nål i andra änden av slangen.
4. Upprepa steg 4,2 för alla de återstående hålen.
5. Samla 1 mL chemotaxis buffert (CB) i en 3 ml spruta, var noga med att ta bort luftbubblor från sprutan.
6. Fixa en nål nav till ena änden av utloppet slangen.
7. Lägg CB till nålen nav och tryck nålen navet för att avlägsna eventuella luftbubblor.
8. Skjut lite CB ut ur spetsen på sprutan och anslut 3 ml sprutan med nålen navet utan att fånga luft.
9. Tryck CB genom enheten tills alla kvarvarande nål nav är fyllda med med CB. Detta bör ta bort en majoritet av luftbubblor.
10. Fyll två 500μL sprutor med CB som innehåller lämpliga koncentrationer av chemoeffector testade varelse. Eliminera bildning luftbubbla genom att skjuta ut en liten droppe av sprutans innehåll och röra ner till vätskan i nålen nav och fästa.
11. Likaså ansluta en spruta med CB för bakterien inlopp. Detta kommer att tas bort när bakterier förs in i enheten.

5. Tillväxten av mycket rörliga E. coli

1. Odla natten kulturer av E. coli RP437 med GFP uttryck plasmid i 20 ml trypton buljong (TB) vid 32 ° C med skakning. Tillsätt lämpliga koncentrationer av antibiotika för att upprätthålla plasmiden. I våra protokoll, använder vi en låg kopia plasmid pCM182 för att upptäcka bakterier baserade på fluorescens i enheten. För E. coli, växande kulturer vid 32 ° C rekommenderas för hög motilitet, som motilitet är lägre vid högre temperaturer.
2. Använd natten kulturen att inokulera en 20 ml kultur av tbc i en 250 ml E-kolv med en optisk densitet på 600 Nm på ~ 0,05. Odla kulturen med skakning vid 32 ° C.
3. Harvest cellerna på en OD ₆₀₀ på ~ 0,35 0,45 av låg hastighet centrifugering vid 400 xgi 5 minuter.
4. Resuspendera celler för att en OD ₆₀₀ på ~ 0,35 i CB innehåller chemoeffector på koncentrationen väntas i mitten av kanalen.
5. Lägg till RFP-märkta döda celler på en OD ₆₀₀ på ~ 0,35 till GFP-uttryckande levande celler. De döda (röd) celler används som en intern kontroll för att säkerställa att migrationen inte beror på flödet effekter.

6. Övervakning chemotaxis

1. Ta del av CB från cellen inlopp nålnav. Fyll på med cellsuspensionen.
2. Försiktigt fylla 50μL sprutan med återsuspenderade celler. Detta steg måste göras långsamt som flageller kan klippas och kommer att minska rörligheten.
3. Fäst 50μL sprutan till inloppet-nål nav enligt steg steg 4,10.
4. Placera enheten på scenen av en fluorescensmikroskop utrustad med en höghastighetskamera för bild förvärvet. Placera inloppet sprutor (både 500 mikroliter lutning sprutor och 50 mikroliter cellen spruta) i sprutpumpen och initiera flöde så att lutning bildas och cellerna flyter genom slangen.
5. När celler in i chemotaxis kammare, vänta ca 20 min för systemet att stabiliseras innan avbildning.
6. Samla gröna (live) och röd (döda) fluorescens bilder på olika platser längs kammaren (motsvarar olika exponeringstider). Normalt samlar vi in ​​100 bilder på varje plats med 3 sek mellanrum.

7. Dataanalys: Följande steg kan utföras med hjälp av några kommersiellt tillgängliga program bildanalys (t ex ImageJ, metamorfa) eller med hjälp av enkla koder skrivna i Matlab.

1. Ta bort bakgrunden pixlar i bilden (dvs ställa tröskeln pixel intensitet och ta bort alla pixlar som har intensitet under gränsen). Detta minimerar störningar i analysen.
2. Använd läget för döda celler (röd fluorescens) för att bestämma mitten av bilden. Eftersom de döda cellerna visar inga chemotaxis är detta den position där cellerna in i chemotaxis kammaren och kan upptäckas i avsaknad av migration.
3. Leta levande celler (grön fluorescens) i bilden.
4. Dela bilden i kanaler och bestämma antalet levande celler i varje kanal. I vårt tidigare arbete ^3, var 1050 ìm breda chemotaxis kammare uppdelad i 64 kanaler som varje ~ 16 ìm breda.
5. Upprepa steg 7,1 7,3 för alla bilder och summera totala celler för varje kanal på alla bilder. Detta ger totalt cellantal upptäcks på varje kanal under hela experimentet.
6. Beräkna chemotaxis delningskoefficient (CPC), som representerar riktningen av migration, enligt följande: Varje cell finns i hög koncentration (höger) och låga koncentrationer (vänster) sida av döda celler tilldelas en multiplikator på +1 och -1 , respektive. Det är, en cell som vandrar upp en lutning multipliceras med 1, medan celler rör sig nedåt i lutning multipliceras med -1. Alla multiplicerade värden summeras och normaliserade till det totala antalet upptäckta celler. Till exempel visar en CPC-värde på 0,40 att 40% av den totala bakterier flyttas till den höga koncentrationen sidan än på den låga koncentrationen sidan (dvs chemoeffector är ett lockmedel som mer bakterier upptäcktes att flytta upp lutning).
7. Beräkna chemotaxis migration koefficienten (CMC), som väger migration av celler genom den sträcka, som följer: Vikt antalet celler i varje kanal med en faktor som är proportionell mot avståndet att celler migrera. En cell som flyttas till längst hög koncentration läge (kanal 64) ges en viktningsfaktor för en, medan en som rör sig halvvägs in i högre koncentration sidan ges en viktningsfaktor på 0,5, och en cell flyttar till längst låg koncentration position är viktat med -1. Summera alla de viktade celltal och normalisera till antalet celler att generera CMC.

Representativa resultat ^3,4:

Vi har använt mikroflödessystem enhet (Figur 1A) som beskrivs här att undersöka chemotaxis E. coli i gradienter av tilldragande (asparaginsyra, autoinducer-2) och repellerande medel (NISO _4, indol) ^3,4. Den prototypiska chemotaxis stammen ⁵ E. coli RP437 uttrycka GFP användes tillsammans med kanamycin-dödade E. coli-TG1 celler som uttrycker rött fluorescerande protein för att övervaka flödet effekter. Koncentrationen gradient bildas i μFlow enheten visas i figur 1B. Cellen inloppet capped så att det inte fanns något flöde genom den och en stabil lutning 0 100 ng / ml fluoresscein grundades i enheten. Pixeln intensitet över hela anordningen används för att bestämma koncentrationen profil fluorescein. Uppgifterna visar att bakterierna stöter på en linjär övertoning när de träder in chemotaxis kammaren. Figur 2A och B visar fluorescens bilder av E. coli RP437 migrerar som svar på gradienter av asparaginsyra (0 100 mikroM) och NISO ₄ (0 225 M). De observerade svaren på dessa kanoniska lockmedel och frånstötande är som förutspås. Figur 3A visar kvantifierad fördelning av E. coli RP437 i avsaknad av en koncentration gradient (dvs null lutning asparaginsyra) medanSiffror 3B och C visar fördelningen i gradienter av asparaginsyra och NISO _4. Specificiteten av dessa svar (dvs bias i migration) är uppenbart som ett E. coli RP437 Δ tjära stam (dvs. stam saknar Tar chemoreceptor som används i E. coli för att känna av asparaginsyra och nickel) visar inte på partiskhet i migration i närvaro av en koncentration lutning asparaginsyra eller NISO _4. De trender som tydligt i den rumsliga fördelningen profilerna är också förenliga med den beräknade CPC och CMC värden. CPC värden för migration av E. coli RP437 i övertoningar med asparaginsyra eller NISO ₄ är 0,33 och -0,33, respektive. Motsvarande CMC värden är 0,13 och -0,14, respektive. Däremot CPC och CMC värden med E. coli RP437 Δ tjära stam i övertoningar med asparaginsyra eller NISO ₄ är försumbara. Dessutom CPC och CMC i ett null lutning på asparaginsyra är 0,03 och 0,02, respektive, och visar brist på partiskhet i migration i avsaknad av en övertoning.

Figur 1. Enhet schematisk och koncentration lutning.
(A) Schematisk representation av mikroflödessystem chemotaxis enhet. Enheten består av en gradient-mixning-modul (20 x 100 x 18.750 mikrometer) och ett kemotaxi observation modul (20 x 1050 x 11.500 mikrometer). Bredden av de två lutning kanalerna kommer in i enheten är 500 ìm och bredden på bakterier inlopp med 50 mm. Den infällda bilden visar en lutning på signalmolekyl (grå) och bakterier vandrar som svar på det. Levande bakterier framställs som solida ovaler, medan döda bakterier visas som öppna ovaler. (B) en koncentration gradient mellan 0 och 100 ng / mL fluorescein genererades på enheten och avbildas med fluorescensmikroskopi. Fluorescens bilder förvärvades efter 30 min och kvantifieras av bildanalys.

Figur 2. Chemotaxis av E. coli RP437 i mikroflödessystem enhet.
E. coli RP437 utsattes för en lutning (A) 000-100 mikroM L-aspartat eller (B) 0-225 mikroM NISO ₄ i enheten och migrationen av levande bakterier (grön) mot L-aspartat eller bort från nickel avbildade varje 2,5 sek i 30 min. Döda bakterier (röd) fungerade som kontroll för flöde effekter i enheten. Bilderna var kvantifieras med hjälp av en egenutvecklad analys program3. De redovisade siffrorna är representativa pseudo-färgade bilder från tre oberoende försök.

Figur 3: Kvantifiering av migrationsprofiler till en kanonisk lockmedel och frånstötande.
Geografisk utbredning av RP437 i mikroflödessystem enhet som svar på (A) enhetlig 100 mikroM L-aspartat (dvs ingen lutning), (B) en 0 100 mikroM lutning aspartat, och (C) en 0 225 mikroM lutning NISO ₄ . Fördelningen av döda celler visas som en heldragen linje, är fördelningen av RP437 celler visas som en streckad linje, och fördelningen av RP437 EDA ⁺ Δ tjära celler visas som en prickad linje. De redovisade siffrorna är genomsnitt för tre oberoende försök.

Den chemotaxis fördelningskoefficient (CPC) och kemotaxi migration koefficienten (CMC) kan beräknas enligt beskrivningen i Mao et al ^5. Om en cell upptäcks på den höga koncentrationen sidan ges det ett värde på 1, medan en cell upptäcks på den låga koncentrationen sidan ges ett värde på -1. Värdena summeras och delas med det totala antalet celler att generera CPC. Tecknet för CPC (positiv eller negativ) ger riktning migration (mot eller bort från en signal). Även om CPC visar om cellerna svarar på en kemikalie som ett lockmedel eller motbjudande, det gör det inte kvantifiera omfattningen av chemotaxis. För detta beräknar vi CMC genom att dividera den rumsliga fördelningen profil bakterier över hela bredden av enheten i 64 avsnitt (32 på varje sida av cellen inlopp), och tilldela en viktningsfaktor till celler i varje avsnitt bygger på avstånd migration. Avsnitten längst bort från centrum (avsnitten 1 och 64) multipliceras med en (= 31.5/31.5) eller -1 eftersom de innehåller celler som har migrerat det maximala avståndet. De följande två avsnitten (2 och 63) multipliceras med 0,968 (= 30.5/31.5) eller -0,968. De sista två avsnitten (dvs 32 och 33 som är närmast cellen inlopp) multipliceras med + 0,015 (= 0.5/31.5) eller -0,015. Den viktade värden summeras och normaliserade till det totala antalet celler att generera CMC. En CMC av ett indikerar att alla bakterier flyttas helt upp lutningen mot väggen av flödet kammaren. Vid en mild attraktiva svar, skulle CMC fortfarande vara en positiv, men har ett mindre värde, medan CPC-värdet skulle fortfarande vara en. Således CMC diskriminerar lyhörd celler baserat på omfattningen av migration.

Vissa parametrar måste kontrolleras noggrant när de utför chemotaxis experiment. Den temperatur vid vilken bakterierna odlas är viktigt. För E. coli har vi konstaterat att den bästa tillväxten temperaturen är 32 ° C och högre temperaturer minskar motilitet. För vissa receptorer att vara närvarande i bakterier, kan det vara nödvändigt att odla bakterien i närvaro av en förmå chemoeffector (dvs att prima celler för chemotaxis). Till exempel när man undersöker svaret av bakterier till maltos, är celler som odlas med 0,1% (w / v) av socker. När resuspending bakterierna efter centrifugering, är det viktigt att försiktigt skaka / rullning av röret sker och cellerna är inte vortexed. Kraftig skakning kan klippa flageller och minska motilitet i cellerna som testas. De flöden som används i produkten måste bestämmas utifrån motilitet av bakterien som testas. Långsammare flöde kan krävas för bakterier som är mindre rörliga, och den optimala flödeshastigheten måste bestämmas empiriskt.

Vi räknar med att μFlow enheten kan användas för grundläggande utredningar om bakteriella chemotaxis (t.ex. konkurrens mellan chemoeffectors för samma receptor) samt att identifiera bakterier i miljöprover som reagerar på vissa kemikalier som tilldragande eller repellenter.