Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

1. Standart SU-8 fotolitografi ¹ (Bu video görünmez) kullanılarak silikon ustaların Fabrikasyon.

1. Mikroakışkan ağ ve kemotaksis odasına içeren PDMS kalıp imalatı için SU-8 "master" (SÜ-8 2025, MicroChem, Newton, MA) oluşturmak için standart SU-8 fotolitografi yöntemleri kullanın. Böyle bir ana kalıp herhangi bir mikroimalat tesisi (örneğin, Stanford Mikroakiskan Döküm http://thebigone.stanford.edu/foundry/ imal edilebilir) .
2. PDMS çoğaltma önce ana PDMS kolay bırakma kolaylaştırmak için bir vakum kaynağına bağlı bir desikatöre fluorosilane buhar SU-8 master ortaya bir kağıt havlu fluorosilane bir damla ekleyin ve bir dakika süreyle vakum uygulamak. Vakum çıkarın ve fluorosilane birikimi için 30 dakika izin verin. SU-8 ana ileride kullanmak üzere kapalı bir kapta tutun.

2. SU-8 ustadan PDMS Replica kalıplama: akışkan katman ve kontrol katmanı SU-8 master PDMS çoğaltma kalıplama yapılır.

1. 10:01 ağırlıkça PDMS pre-polimer ve çapraz bağlayıcı karıştırın. 1 saat (ya da hava kabarcıkları PDMS karışımından kaldırılana kadar) bir desikatöre oranı ve gazını.
2. Petri SU-8 ana yerleştirin ve dikkatli bir şekilde istenilen kalınlıkta SU-8 ustanın üstüne PDMS karışımı dökün.
3. PDMS ve 80 ° C iki saat PDMS tedavi SU-8 ana kalıp içeren petri ısıtın.
4. Kaldır tedavi PDMS-kapalı ocak SU-8 master ve SU-8 master PDMS kalıp kabuğu. İstenen yapı PDMS kalıp içinde gömülü olacaktır.
5. 20 gauge künt uç iğne kullanarak degrade jeneratör ve hücre giriş boru PDMS kalıp delgeç.

3. PDMS cihazları Bağlar:

1. Izopropanol ve azot veya hava akımı ile kuru bir cam mikroskop lamı temizleyin.
2. PDMS ve bir plazma temizleyici oksijen plazma cam slayt Açığa.
3. Cam slayt ile temas PDMS kalıp getirin. Temas slayt ve PDMS kalıp Isı 65 ° C 15 dk.

4. PDMS cihaz Montaj

1. Bir jilet kullanarak boru kesme, 45 °, cihaz için gerekli olan doğru uzunlukta açı.
2. Forseps kullanarak aygıt (örneğin, çıkış) delikli deliklere hortumun bir ucunu.
3. Forseps kullanarak, hortumun diğer ucunu bir künt 30-gauge iğne takın.
4. Kalan tüm delikleri için adım 4.2 tekrarlayın.
5. Kemotaksis tampon (CB), bir 3ml şırınga şırınga hava kabarcıkları özen 1mL toplayın.
6. Çıkış hortumun bir ucunu bir iğne merkezi sabitleyin.
7. CB iğne hub ekleyin ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için iğne hub dokunun.
8. CB şırınga ucu biraz dışarı itin ve hava hapsi olmadan 3ml şırınga iğne hub bağlamak.
9. CB, CB ile geriye kalan tüm iğne hub dolana kadar cihaz üzerinden itin. Bu hava kabarcıkları büyük bir çoğunluğu kaldırmanız gerekir.
10. CB ile chemoeffector denenmektedir uygun konsantrasyonları içeren iki 500μL şırınga doldurun. Şırınga içeriğini küçük bir damla dışarı iterek ve dokunarak ve iğne merkezi sıvı açılan takılarak hava kabarcığı oluşumunu ortadan kaldırır.
11. Benzer şekilde, CB bakteri girişine içeren bir şırınga bağlayın. Bakteri cihazın içine sunulduğunda bu silinecektir.

5. Son derece hareketli E. Büyüme coli

1. Grow E. gecede kültürlerin coli sallayarak Tripton suyu (TB) ile 32 ° C'de 20 ml plazmid bir GFP ifade ile RP437. Plazmid korumak için uygun antibiyotik konsantrasyonları ekleyin. Protokolde, düşük kopya cihaz floresan dayalı bakteri tespit için bir plazmid pCM182 kullanın. E. için coli, 32 büyüyen kültürler ° C motilitesi yüksek sıcaklıklarda daha düşük olduğu gibi, yüksek hareketlilik açısından tavsiye edilir.
2. 250 mL Erlenmeyer şişesinin ~ 0.05 600Nm bir optik yoğunluk TB 20 ml kültür aşılamak için bir gecede kültür kullanın. 32 sallayarak kültür büyütün ° C
3. 5 dakika boyunca 400 xg'de düşük hızda santrifüj ~ 0.35 0.45 OD ₆₀₀ hücreleri Hasat.
4. Chemoeffector kanalın ortasında beklenen konsantrasyon içeren CB ~ 0.35 OD ₆₀₀ hücreleri tekrar
5. GFP ifade canlı hücreler bir OD ₆₀₀ ~ 0.35 RFP etiketli ölü hücreleri ekleyin. Ölü hücreleri (kırmızı), herhangi bir göç akışı etkileri nedeniyle olmadığından emin olmak için bir iç kontrol sistemi olarak kullanılmaktadır.

6. İzleme kemotaksis

1. Hücreye giriş iğne CB kısmını çıkarıngöbeği. Yedek hücre süspansiyonu ile.
2. 50μL şırınga yavaşça yeniden süspanse hücreleri ile doldurun. Bu adım, kamçı makaslanmış gibi yavaş yavaş yapılması gerektiğini ve motilite azaltacaktır.
3. 50μL şırınga adım adım 4.10 'da açıklandığı gibi giriş-iğne hub'a takın.
4. Görüntü elde etmek için yüksek hızlı bir kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop aşamasında cihazı yerleştirin. Giriş şırınga (her ikisi de 500 mcL degrade şırınga ve 50 mcL hücre şırınga) şırınga pompası içine yerleştirin ve degrade oluşur ve hücreleri borudan akan akışını başlatmak.
5. Hücreleri kemotaksis odasına girin görüntüleme önce istikrara kavuşturmak için sistem için ~ 20 dakika bekleyin.
6. Odanın uzunluğu boyunca farklı yerlerde (farklı pozlama süreleri karşılık gelen), yeşil (canlı) ve kırmızı (ölü) floresan görüntüleri toplayın. Genellikle, 100 görüntü 3 saniye aralıklarla her yerde toplamak.

7. Veri analizi: aşağıdaki adımları kullanarak veya herhangi bir piyasada bulunan görüntü analiz programı (örneğin, ImageJ, Metamorph) Matlab yazılmış basit kodlar kullanılarak yapılabilir.

1. Arka plan piksel görüntü (yani, set eşik piksel yoğunluğu ve eşik daha az bir yoğunluk var tüm pikselleri kaldırmak) çıkarın. Analizinde bu gürültü en aza indirir.
2. Görüntünün merkezini belirlemek için ölü hücreleri (kırmızı floresan) pozisyonunu kullanın. Ölü hücreleri yok kemotaksis gösteren bu yana, bu hücreleri kemotaksis odasına girdi ve herhangi bir göç yokluğunda tespit olacaktır konumu temsil eder.
3. Görüntüyü canlı hücreleri (yeşil floresan) bulun.
4. Kanal içine görüntü bölün ve her kanalda canlı hücrelerinin sayısını belirlemek. Önceki ^3, 1050 mikron genişliğinde kemotaksis odasının her ~ 16 mikron genişliğinde 64 kanal ayrıldı.
5. Tüm fotoğraflar için 7.1 7.3 adımları tekrarlayın ve her kanal için tüm görüntüleri üzerinden toplam hücre sayıları toplamı. Bu deney süresi boyunca her kanal tespit edilen toplam hücre sayımı verir.
6. +1 Ve -1 çarpanı, yüksek konsantrasyon (sağda) ve düşük konsantrasyonda (sol), ölü hücreler kenarlarında bulunan Her hücre atanır aşağıdaki gibidir: göç yönü temsil kemotaksis partisyon katsayısı (TBM), hesaplayın sırasıyla. Yani, degrade aşağı hareket hücreleri -1 ile çarpılır ise degrade +1 ile çarpılır kadar göç bir hücre. Çarpılarak tüm değerleri eklendi ve tespit edilen hücrelerin toplam sayısı normalize edilir. Örneğin, bir TBM değeri 0.40, toplam bakteri% 40 daha düşük konsantrasyonda tarafı (yani, daha fazla bakteri degrade yukarı hareket tespit edildi chemoeffector Cezbedici) daha yüksek konsantrasyon tarafına taşınmış olduğunu gösterir.
7. Kemotaksis göç göç ettiğini hücreleri mesafe ile orantılı bir faktör her kanalda Ağırlık hücre sayısı aşağıdaki gibidir: mesafe hücrelerinin göç, seyahat ağırlığında katsayısı (CMC), hesaplayın. Yüksek konsantrasyon tarafına yarım hareket bir ağırlık faktörü 0,5 ise, uzak yüksek konsantrasyon pozisyonlar (kanal 64) ile hareket eden bir hücre +1 bir ağırlık faktörü göz önüne alındığında, ve uzak bir hücre -1 ile düşük konsantrasyon konumunu ağırlıklı. Tüm ağırlıklı hücre sayıları toplamı ve CMC oluşturmak için hücre sayısı normale.

Temsilcisi Sonuçlar ^3,4:

Biz kullanılan mikroakışkan cihazı (Şekil 1A) E. kemotaksis araştırmak için buradayız cezbedicilerde (aspartik asit, autoinducer-2) ve kovucular (Niso _4, indol) ^3,4 Degradelerde coli. Prototip kemotaksis zorlanma ⁵ E. coli RP437 ifade GFP kanamisin-öldürülen E. ile birlikte kullanılır. akış etkilerini izlemek için kırmızı floresan proteini ifade coli TG1 hücreleri. Şekil 1B μFlow cihazda oluşan konsantrasyon farkı gösterilmiştir. Hücre giriş üzerinden akış ve 0 100 fluoresscein ng / ml cihaz yılında kurulmuştur istikrarlı bir eğim vardı, böylece kapatılmış oldu. Cihaz üzerinde piksel yoğunluğu floresein konsantrasyonunun profilini belirlemek için kullanılmıştır. Veri kemotaksis odasına girdiğinizde bakteriler doğrusal bir degrade karşılaştıkları göstermektedir. Şekil 2A ve B E. floresan görüntüleri gösterir . aspartik asit (0 100 mcM) ve Niso ₄ (0 225 mcM) degradeler yanıt coli RP437 göç. Gözlenen bu kanonik cezbedici yanıtları ve itici tahmin edilmektedir. Şekil 3A E. sayısal dağılımını göstermektedir coli RP437 konsantrasyon farkı olmaması (yani, boş degrade aspartik asit),Şekiller 3B ve C aspartik asit ve Niso ₄ gradyanlar dağılım gösterir. Bu yanıtların özgüllük (yani, göç önyargı) E. olarak açıktır coli RP437 Δ tar suşu (örneğin, E. coli aspartik asit ve nikel anlamda kullanılan Tar kemoreseptör eksik suşu), aspartik asit _veya 4 Niso bir konsantrasyon gradiyenti varlığı göç önyargı göstermek değil . Mekansal dağılımının profilleri belirgin eğilimleri de hesaplanan TBM ve CMC değerleri ile tutarlı. E. göç TBM değerleri aspartik asit veya Niso ₄ gradyanlar coli RP437 sırasıyla 0,33 ve -0,33,. Ilgili CMC değerleri sırasıyla 0,13 ve -0,14,. E. aksine, TBM ve CMC değerleri aspartik asit veya Niso ₄ gradyanlar coli RP437 Δ tar gerginlik önemsizdir. Buna ek olarak, bir boş degrade aspartik asit TBM ve CMC sırasıyla 0,03 ve 0,02, ve bir degrade yokluğunda göç yanlılık eksikliği gösterir.

Şekil 1. Aygıt şematik ve konsantrasyon farkı.
(A) mikroakışkan kemotaksis cihazının şematik gösterimi. Cihaz bir degrade karıştırma modülü (20 x 100 x 18750 mm) ve kemotaksis gözlem modülü (20 x 1050 x 11500 mm) oluşur. Cihaz giren iki degrade kanal genişlikleri 500 mm ve bakteri giriş genişliği 50 mm. Içerlek sinyal molekülüne (gri) ve buna yanıt olarak göç eden bakterilerin bir degrade gösteriyor. Ise ölü bakteri açık oval olarak gösterilen Live bakteri, katı oval olarak tasvir edilmektedir. (B) 0 ile 100 ng / ml floresein arasındaki konsantrasyon farkı cihaz oluşturulan ve floresan mikroskopi kullanılarak görüntülendi. Floresan görüntüleri 30 dakika sonra elde edilen ve görüntü analizi ile ölçüldü.

Şekil 2. E. Kemotaksis coli RP437 mikroakışkan cihaz.
E. coli RP437 bir degrade maruz kalan (A) 0-100 mcM L-aspartat veya (B) 0-225 cihaz mcM _{Niso 4} ve göç canlı bakteri (yeşil), L-aspartat doğru veya nikel 30 dakika boyunca her 2.5 saniye görüntülenmiş. Ölü bakteriler (kırmızı), cihazın akış etkileri kontrol olarak görev yaptı. Görüntü analizi program3 geliştirilen bir evi kullanılarak ölçüldü. Gösterilen veriler, üç bağımsız deneyler temsilcisi sözde renkli görüntüler.

Şekil 3: kanonik cezbedici ve itici göç profilleri Niceleme.
Yanıt mikroakışkan cihaz RP437 mekansal dağılımı (A) üniforma mcM 100 L-aspartat (yani, degrade), (B) aspartat 0 100 mcM degrade, (C) ve Niso ₄ 0 225 mcM degrade . RP437 hücrelerin ölü hücreleri dağılımı bir düz çizgi olarak gösterilir, dağıtım kesik çizgi olarak gösterilir ve RP437 eda ⁺ Δ tar hücrelerinin dağılımı, bir noktalı çizgi olarak gösterilir . Gösterilen veriler üç bağımsız deneyler için ortalaması alınır.

Kemotaksis bölüm katsayısı (TBM) ve kemotaksis göç katsayısı (CMC), Mao ve ^ark 5 açıklandığı gibi hesaplanır . Düşük konsantrasyonda tarafında tespit edilen bir hücre -1 değeri verilir ise, yüksek konsantrasyon tarafına bir hücre tespit edilirse, 1 değeri verilir. Değerleri toplanır ve toplam hücre sayısına göre TBM oluşturmak için ayrılmıştır. TBM (pozitif ya da negatif) işareti göç yönü (bir sinyal doğru veya uzak) verir. TBM hücreleri ya da cezbedici bir itici, kemotaksis ölçüde ölçmek değildir olarak kimyasal bir tepki olmadığını gösterir rağmen. Bunun için mesafe dayalı cihazın genişliği boyunca 64 bölümleri (hücre girişinin her iki tarafında 32) içine bakterilerin mekansal dağıtım profili bölünmesi ve her bölümde hücrelere bir ağırlık faktörü atama CMC hesaplamak göç. Merkezi (Bölüm 1 ve 64) en uzak bölümleri maksimum mesafe göç etmiş hücrelerin içerdikleri +1 (= 31.5/31.5) veya -1 ile çarpılır. Sonraki iki bölümde (2 ve 63) 0,968 (= 30.5/31.5) veya -0,968 çarpılır. Son iki bölümde (yani hücre girişine yakın, 32 ve 33) + 0.015 (= 0.5/31.5) veya -0,015 çarpılır. Ağırlıklı değerler toplanır ve CMC oluşturmak için hücrelerinin toplam sayısı normalize edilir. +1 CMC, tüm bakteri akış odasının duvarına tamamen degrade kadar taşıdığınız gösterir. Hafif çekici bir yanıt durumunda, CMC TBM değeri hala 1 olurdu oysa hala pozitif olabilir, ama daha küçük bir değere sahip. Böylece CMC duyarlı hücreler göç ölçüde dayalı ayrımcılık.

Bazı parametreler kemotaksis deneyler yaparken dikkatli bir şekilde kontrol edilmesi gerekir. Bakteri ekili olan sıcaklık önemlidir. E. için coli, biz en iyi büyüme sıcaklığı 32 ° C ve daha yüksek sıcaklıklarda motilite azaltmak olduğunu gözlemledik. Belirli reseptörleri bakteri mevcut olması için, indükleyici chemoeffector bir varlığı (yani, kemotaksis hücreleri başbakan) bakteriler büyümek için gerekli olabilir. Örneğin, bakteri maltoz yanıt soruşturma, hücreleri şeker% 0,1 (w / v) ile yetiştirilmektedir. Santrifüj sonra bakteri resuspending, nazik sallayarak / tüp haddeleme yapılır ve hücreleri vortekslenmiş olmadığı önemlidir. Güçlü sallayarak test edilen hücrelerin motilite azaltmak kesme kamçı. Cihazda kullanılan akış hızları test edilen bakterinin motilitesi dayalı tespit edilmesi gerekmektedir. Yavaş akış oranları daha az hareketli olan bakteriler için gerekli olabilir ve optimal akış hızı deneysel olarak tespit edilmelidir.

Biz μFlow cihaz bakteriyel kemotaksis (örneğin, aynı reseptör chemoeffectors arasındaki rekabet) yanı cezbedicilerde ve kovucular gibi belirli kimyasallar cevap çevre örneklerinde bakteri tespit temel araştırmalar için kullanılabileceğini tahmin ediyoruz.