Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

1. Fabricación de los maestros de silicio estándar con SU-8 fotolitografía ¹ (no se muestra en este video).

1. El uso estándar de SU-8 métodos de fotolitografía para crear un SU-8 "maestro" (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) para la fabricación del molde PDMS que contiene la red de microfluidos y cámara de quimiotaxis. Moldes como maestro se pueden fabricar en cualquier centro de microfabricación (por ejemplo, Stanford microfluídica de fundición; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. Antes de la replicación PDMS, exponer el SU-8 amo a fluorosilane vapor en un desecador conectado a una fuente de vacío para facilitar la liberación fácil de PDMS del maestro. Añadir una gota de fluorosilane a una toalla de papel y aplicar vacío durante un minuto. Retire el vacío y dejar 30 minutos para la deposición de fluorosilane. Mantenga el SU-8 maestro en un recipiente cerrado para su uso futuro.

2. Moldeo réplica de PDMS de SU-8 master: La capa de fluido y la capa de control son realizadas por moldeo réplica de PDMS de SU-8 maestro.

1. Mezclar el PDMS pre-polímero y la cruz enlazador en un peso de 10:01. relación y desgasificar en un desecador durante 1 hora (o hasta que las burbujas de aire de la mezcla de PDMS).
2. Coloque el SU-8 maestro en una placa de Petri y con cuidado vierta la mezcla de PDMS en la parte superior de la SU-8 amo hasta el grosor deseado.
3. Calentar la cápsula de Petri que contiene el PDMS y el SU-8 molde maestro a 80 ° C durante dos horas para curar el PDMS.
4. Quite la cubierta de curado PDMS SU-8 maestros de la placa y la cáscara del molde PDMS de la SU-8 maestro. La estructura deseada se integrará en el molde de PDMS.
5. Haga agujeros en el molde de PDMS para la tubería del generador de gradiente y la entrada de la celda con un calibre 20 de extremo romo de la aguja.

3. La vinculación de los dispositivos de PDMS:

1. Limpiar un portaobjetos de vidrio con isopropanol y se seca con nitrógeno o una corriente de aire.
2. Exponer el PDMS y portaobjetos de vidrio de plasma de oxígeno en un incinerador de plasma.
3. Lleva el molde de PDMS en contacto con la lámina de vidrio. El calor de la diapositiva en contacto con el moho y PDMS a 65 ° C durante 15 min.

4. Montaje del dispositivo de PDMS

1. Usando una hoja de afeitar, cortar los tubos en un ángulo de 45 ° a la longitud correcta requerida para el dispositivo.
2. Inserte un extremo del tubo en los agujeros perforados en el dispositivo (por ejemplo, de salida) el uso de fórceps.
3. Con unas pinzas, inserte un objeto contundente de calibre 30 aguja en el otro extremo de la tubería.
4. Repita el paso 4.2 para todos los hoyos restantes.
5. Recoger 1 ml de buffer de la quimiotaxis (CB) en una jeringa de 3 ml, teniendo cuidado de eliminar las burbujas de aire de la jeringa.
6. Fijar una base de la aguja en un extremo de la tubería de salida.
7. Añadir CB a la base de la aguja, y toque en el pabellón de la aguja para eliminar cualquier burbuja de aire.
8. Empujar un poco más de CB de la punta de la jeringa y conectar la jeringa 3 ml a la base de la aguja sin atrapamiento de aire.
9. Push CB a través del dispositivo hasta que todos los centros de aguja restantes se rellenan con con el CB. Esto debería eliminar la mayoría de las burbujas de aire.
10. Llenar dos jeringas con 500μL CB contienen las concentraciones adecuadas de la chemoeffector se está probando. Eliminar la formación de burbujas de aire, empujando un pequeño descenso del contenido de la jeringa y tocar la gota del líquido en la base de la aguja y colocar.
11. Del mismo modo, conectar una jeringa que contiene CB a la entrada de bacterias. Esto se quitará cuando las bacterias se introducen en el dispositivo.

5. Crecimiento de la gran movilidad E. coli

1. Crecer cultivos de una noche de E. coli RP437 con una expresión de plásmido GFP en 20 ml de caldo de triptona (TB) a 32 ° C con agitación. Añadir las concentraciones adecuadas de antibióticos para mantener el plásmido. En nuestro protocolo, se utiliza un plásmido pCM182 bajos copia para la detección de las bacterias sobre la base de la fluorescencia en el dispositivo. Para E. coli, cultivos en crecimiento a 32 ° C se recomienda para la movilidad de alta, como la movilidad es menor a temperaturas más altas.
2. Utilice el cultivo de una noche para inocular un cultivo de 20 ml de la tuberculosis en un matraz Erlenmeyer de 250 ml a una densidad óptica a 600 nm de ~ 0,05. Mantener el cultivo con agitación a 32 ° C.
3. Recoger las células en un ₆₀₀ OD de 0.35 ~ 0.45 por centrifugación a baja velocidad a 400 xg durante 5 min.
4. Resuspender las células a un OD ₆₀₀ de ~ 0,35 en CB contiene el chemoeffector en la concentración prevista en el medio del canal.
5. Añadir RFP marcado con las células muertas con un diámetro exterior de ₆₀₀ ~ 0,35 a las células que expresan GFP-vivir. Los muertos (rojo), las células se utilizan como un control interno para garantizar que cualquier migración no es debido a los efectos de flujo.

6. Quimiotaxis de vigilancia

1. Eliminar algunos de los CB de la aguja de entrada de la celdacentro. Rellenar con la suspensión celular.
2. Llenar la jeringa con suavidad 50μL con las células resuspendidas. Este paso se debe hacer lentamente a medida que los flagelos puede ser cortado y reduce la motilidad.
3. Conecte la jeringa 50μL a la entrada del centro con aguja como se describe en el paso pasos 4.10.
4. Colocar el dispositivo en el escenario de un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de alta velocidad para la adquisición de imágenes. Las jeringas de entrada (tanto en el gradiente de 500 jeringas de l y la jeringa de 50 células l) en la bomba de jeringa e iniciar el flujo de tal manera que el gradiente se forma de las células y circula por la tubería.
5. Una vez que las células entran en la cámara de quimiotaxis, espere aproximadamente 20 minutos para que el sistema se estabilice antes de la imagen.
6. Recoger verde (en vivo) y rojo (muertos) imágenes de fluorescencia en diferentes lugares a lo largo de la longitud de la cámara (que corresponden a diferentes tiempos de exposición). Típicamente, recopilamos 100 imágenes en cada lugar en intervalos de 3 segundos.

7. Análisis de datos: Los siguientes pasos se pueden realizar utilizando cualquier programa de análisis de imagen disponibles en el mercado (por ejemplo, ImageJ, Metamorph) o el uso de códigos simples en Matlab.

1. Eliminar los píxeles de fondo en la imagen (es decir, la intensidad de establecer el umbral de píxeles y eliminar todos los píxeles que tienen menos intensidad que el umbral). Esto minimiza el ruido en el análisis.
2. Use la posición de las células muertas (fluorescencia roja) para determinar el centro de la imagen. Dado que las células muertas no muestran quimiotaxis, lo que representa la posición en células entraron en la cámara de quimiotaxis y se detecta en la ausencia de migración.
3. Localizar las células vivas (fluorescencia verde) en la imagen.
4. Dividir la imagen en canales y determinar el número de células vivas en cada canal. En nuestro trabajo previo ^3, la cámara de 1.050 m de ancho quimiotaxis se divide en 64 canales que son cada uno a 16 micras de ancho.
5. Repita los pasos 7,1 7,3 para todas las imágenes y la suma total de células para cada canal a través de todas las imágenes. Esto le da al número total de células detectadas en cada canal durante la duración del experimento.
6. Calcular el coeficiente de partición quimiotaxis (CPC), que representa la dirección de la migración, de la siguiente manera: Cada celda ubicada en la alta concentración (derecha) y baja concentración (izquierda) partes de las células muertas se le asigna un multiplicador de 1 y -1 , respectivamente. Es decir, una célula que migra hacia un gradiente se multiplica por 1, mientras que las células en movimiento a favor del gradiente se multiplican por -1. Todos los valores multiplicados se suman y se normalizaron con el número total de células detectadas. Por ejemplo, un valor de CPC de 0,40 indica que el 40% más del total de bacterias se trasladó a la parte alta concentración de la parte baja concentración (es decir, el chemoeffector es un atractivo a medida que más se detectaron bacterias subiendo la pendiente).
7. Calcular el coeficiente de migración quimiotaxis (CMC), que pesa la migración de las células por la distancia recorrida, de la siguiente manera: Peso contar las células en cada canal por un factor que es proporcional a la distancia que las células migran. Una célula que se mueve hasta el más alejado de la alta concentración de la posición (canal 64) se da un factor de ponderación de 1, mientras que uno que se mueve a medio camino en el lado de mayor concentración se da un factor de ponderación de 0,5, y una célula de trasladarse a la más lejana baja concentración posición ponderada por -1. Resumiendo todos los recuentos de células ponderada y normalizar el número de células para generar el CMC.

Los resultados representativos ^3,4:

Hemos utilizado el dispositivo de microfluidos (Figura 1) se describe aquí para investigar la quimiotaxis de los E. coli en los gradientes de atrayentes (ácido aspártico, autoinductor-2) y repelentes _(NiSO4, indol) ^3,4. El prototipo de la quimiotaxis cepa ⁵ E. coli RP437 GFP expresión se utilizó, junto con la kanamicina mató E. coli TG1 células que expresan la proteína fluorescente de color rojo para vigilar los efectos de flujo. El gradiente de concentración formado en el dispositivo μFlow se muestra en la Figura 1B. La entrada de la celda era máximo, de forma que no hay flujo a través de ella y un gradiente estable de 0 a 100 ng / mL de fluoresscein se estableció en el dispositivo. La intensidad de los píxeles a través del dispositivo se utilizó para determinar el perfil de concentración de fluoresceína. Los datos muestran que las bacterias encuentran un gradiente lineal cuando entran en la cámara de quimiotaxis. Figura 2A y B muestra imágenes de fluorescencia de E. coli RP437 migrar en respuesta a gradientes de ácido aspártico (0 100 mM) y _NiSO4 (0 225 M). Las respuestas observadas a estos atrayente y repelente canónicos son como se predijo. Figura 3A muestra la distribución cuantificada de E. coli RP437 en ausencia de un gradiente de concentración (es decir, la pendiente nula de ácido aspártico), mientras queFiguras 3B y C muestran la distribución de los gradientes de ácido aspártico y _NiSO4. La especificidad de estas respuestas (es decir, el sesgo en la migración) es evidente, como E. coli cepa RP437 Δ tar (es decir, que carecen de la cepa quimiorreceptores alquitrán que se utiliza en E. coli para detectar el ácido aspártico y níquel), no demuestra la tendencia de la migración en la presencia de un gradiente de concentración de ácido aspártico o _NiSO4. Las tendencias observadas en los perfiles de distribución espacial son también consistentes con los valores calculados CPC y CMC. Los valores de CPC para la migración de E. coli RP437 en los gradientes de ácido aspártico o _NiSO4 son 0,33 y -0,33, respectivamente. Los correspondientes valores de CMC son 0,13 y -0,14, respectivamente. Por el contrario, la CPC y CMC valores con el E. RP437 Δ coli cepa de alquitrán en los gradientes de ácido aspártico o _NiSO4 son insignificantes. Además, el CPC y CMC en un gradiente nulo de ácido aspártico son 0,03 y 0,02, respectivamente, e indican la ausencia de sesgos en la migración en la ausencia de un gradiente.

Figura 1. Dispositivo esquemático y un gradiente de concentración.
(A) Representación esquemática del dispositivo de la quimiotaxis de microfluidos. El dispositivo consta de un módulo de gradiente de mezcla (20 x 100 x 18 750 m) y un módulo de observación de la quimiotaxis (20 x 1050 x 11500 mm). El ancho de los dos canales gradiente entren en el dispositivo es de 500 micras y el ancho de la entrada de las bacterias es de 50 micras. El recuadro muestra un gradiente de moléculas de señalización (gris) y las bacterias que migran en respuesta a la misma. Bacterias vivas son representados como óvalos sólido, mientras que las bacterias muertas se muestran como óvalos abiertos. (B) un gradiente de concentración entre 0 y 100 ng / mL de fluoresceína fue generada en el dispositivo y utilizando imágenes de microscopía de fluorescencia. Imágenes de fluorescencia fueron adquiridas después de 30 minutos y se cuantificó mediante análisis de imágenes.

Figura 2. Quimiotaxis de los E. coli RP437 en el dispositivo de microfluidos.
E. coli RP437 fue expuesto a un gradiente de (A) 000 a 100 M de L-aspartato, o (B) 0-225 _NiSO4 M en el dispositivo y la migración de bacterias vivas (verde) sobre la L-aspartato o fuera de níquel imágenes cada segundo 2,5 durante 30 minutos. Las bacterias muertas (rojo) sirvió como control para los efectos de flujo en el dispositivo. Las imágenes fueron cuantificados usando un in-house desarrollado análisis programa3. Los datos mostrados son pseudo-color imágenes de tres experimentos independientes.

Figura 3: Cuantificación de los perfiles de la migración a un atrayente y repelente canónica.
Distribución espacial de la RP437 en el dispositivo de microfluidos en respuesta a (A) uniforme de 100 mM L-aspartato (es decir, sin gradiente), (B) un gradiente de 0 100 M de aspartato, y (C) un gradiente de 0 225 M de _NiSO4 . La distribución de las células muertas se muestra como una línea continua, la distribución de células RP437 se muestra como una línea discontinua, y la distribución de células RP437 eda ⁺ Δ alquitrán se muestra como una línea de puntos. Los datos mostrados son en promedio de tres experimentos independientes.

El coeficiente de partición de la quimiotaxis (CPC) y el coeficiente de migración de la quimiotaxis (CMC) se puede calcular como se describe en Mao et al ^5. Si una célula se detecta en el lado de alta concentración, se le da un valor de 1, mientras que una célula detecta en la parte baja concentración se da un valor de -1. Los valores se suman y se dividen entre el número total de células para generar el CPC. El signo de la CPC (positivo o negativo) de la dirección de la migración (hacia o lejos de una señal). A pesar de la CPC indica si las células responden a un químico como un atrayente o repelente, no cuantifica la magnitud de la quimiotaxis. Para ello, se calcula el CMC dividiendo el perfil de la distribución espacial de las bacterias a través de la anchura del dispositivo en 64 secciones (32 en cada lado de la entrada de la célula), y la asignación de un factor de ponderación a las células en cada sección en base a la distancia de la migración. Las secciones más alejadas del centro (artículos 1 y 64) se multiplican por 1 (= 31.5/31.5) o -1, ya que contienen las células que han migrado de la distancia máxima. Las dos secciones siguientes (2 y 63) se multiplica por 0.968 (= 30.5/31.5) o -0,968. Las dos últimas secciones (es decir, 32 y 33 que están más cerca de la entrada de la celda) se multiplican por + 0.015 (= 0.5/31.5) o -0,015. Los valores ponderados se suman y se normalizaron con el número total de células para generar el CMC. Un CMC de una indica que todas las bacterias se trasladó por completo el gradiente de la pared de la cámara de flujo. En el caso de una respuesta atractiva leve, el CMC seguiría siendo positivo, pero tienen un valor menor, mientras que el valor de CPC seguiría siendo una. Así, el CMC discrimina a las células de respuesta basada en la magnitud de la migración.

Algunos parámetros deben ser cuidadosamente controlados, mientras que la realización de experimentos de quimiotaxis. La temperatura a la que se cultivan los microbios es importante. Para E. coli, se ha observado que la mejor temperatura de crecimiento es de 32 ° C y temperaturas más elevadas reducen la motilidad. Para ciertos receptores de estar presentes en las bacterias, puede ser necesario cultivar la bacteria en la presencia de una inducción chemoeffector (es decir, a la primera de las células de la quimiotaxis). Por ejemplo, al investigar la respuesta de las bacterias a la maltosa, las células se cultivan con el 0,1% (w / v) del azúcar. Cuando resuspensión de las bacterias después de la centrifugación, es importante que sacudir suavemente / balanceo del tubo se realiza y las células no se agitaron. Agitación vigorosa puede cortar los flagelos y reducir la motilidad de las células se está probando. Los caudales utilizados en el dispositivo tendrá que ser determinado con base en la movilidad de la bacteria se está probando. Se reduce la velocidad del flujo puede ser necesaria para las bacterias que son menos móviles, y la velocidad de flujo óptima debe ser determinada empíricamente.

Anticipamos que el dispositivo μFlow puede ser utilizado para investigaciones fundamentales sobre la quimiotaxis bacteriana (por ejemplo, la competencia entre chemoeffectors por el mismo receptor), así como en la identificación de bacterias en muestras ambientales que responden a determinados productos químicos como atrayentes o repelentes.