Low-Stress-Route Learning Mit dem Lashley III Maze in Mäuse

1. Zubereitung:

1. Die Lashley III Labyrinth aus Plexiglas gebaut und ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Startbox, Labyrinth Arme und Ziel box sind modular aufgebaut, um für die Reinigung und Modifizierbarkeit des Labyrinths zu ermöglichen. Die Wände der Startbox, Labyrinth Arme und Ziel-Box sind aus schwarzem Plexiglas gebaut, um visuelle Signale von außen und innen das Labyrinth zu beseitigen. Maze Arme sind 45 cm lang, 7 cm hoch und 5 cm breit. Türen, die zu aufeinanderfolgenden Arme des Labyrinths sind 4 cm x 4 cm und liegen 11 cm von den Außenwänden des Labyrinths. Das Ziel Box ist 19,5 cm lang x 7 cm hoch x 5 cm breit. Die Startbox ist 8 cm x 9,5 cm x 7 cm. Separate Plexiglas Stücke sind auf der Oberseite des Startbox, Labyrinth, und Ziel-Box zur Visualisierung von jeder Maus ermöglichen, wie es durch das Labyrinth fortschreitet und verhindert gleichzeitig Mäuse an der Flucht gestellt. Das Labyrinth steht auf einem Sockel aus rotem Plexiglas, dass groß genug, um die drei Teile des Labyrinths plus eine pseudo-home Käfig, der die gleiche Größe wie das Tier Standard Hause Käfig gehalten wird gebaut.
2. Um pseudo-home Käfige vor dem ersten Labyrinth Versuch, frische Einstreu der gleichen Art wie bei den Tieren "Käfige verwendet, um einzelne Käfig Sumpf mit Türen (2 cm x 2 cm) schneiden in die Seiten eingefügt wird vorbereitet. Legen Draht tops auf diesen Käfig Böden und individuell Zahl ihnen, eine für jedes Tier in einem Test Kohorte. Diese Käfige werden als einzelne Pseudo-home Käfigen für jedes Tier für die Dauer des Tests Zeitrahmen dienen. Weil wir die Untersuchung der Rolle von Stress und / oder Angst-Verhalten bei Lernen und Gedächtnis sind, verwenden wir pseudo-home Käfigen einzeln zu vermeiden Gehäuse Mäuse in ihre Käfige. Allerdings, wenn diese Faktoren nicht von vorrangiger Bedeutung, können Tiere einzeln in Käfigen zu Hause mit Türen und diesen Käfigen modifiziert werden kann als die Heimat Käfige für eine erfolgreiche Labyrinth Navigation dienen, untergebracht werden.

2. Testing:

1. Jeden Tag werden die Tiere auf das Verhalten Testraum ein Minimum von 1 Stunde vor dem Test verschoben, damit sie auf die Testumgebung akklimatisieren.
2. Dreißig Minuten vor der Prüfung Startzeit, Nahrung und Wasser wird aus allen Käfigen Hause entfernt. Halten Sie das Futter und Wasser in das Verhalten Testraum, aber außerhalb der Reichweite von den Mäusen. Lebensmittel und Wasser ist in der Regel 30 Minuten nach dem Wechsel von der leichten Phase der dunklen Phase entfernt, nachdem der Peak Fütterung ist aufgetreten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Tiere sind meist durch Lebensmittel und Wasser-gesättigt vor dem Test, aber Test während dieser Zeit eine kleine zusätzliche treibende Kraft, um das Labyrinth navigieren, obwohl es keine offenen Lebensmittel oder Wasser Belohnung nach Beendigung eines Tasks.
3. Nach der 30 min Pretest abgelaufen ist, reinigen das Labyrinth mit 70% Ethanol. Lassen Sie die Tür, die aus der Startbox in das Labyrinth Arme geschlossen. Die Türen an beiden Enden der Ziel-Box sind offen gelassen.
4. Legen Sie die pseudo-home Käfig entsprechend dem ersten Tier am Ende der Ziel-Box.
5. Tragen Sie die erste Maus, um das Labyrinth, Schröpfen es in der Hand. Legen Sie die Maus in die Startbox und ersetzen Sie den Deckel.
6. Wenn in der Lage, das Labyrinth ohne Behinderung zu beobachten, öffnen Sie die Startbox Tür und sofort beginnt drei Stoppuhren.
7. Wenn alle vier Pfoten der Maus haben die Startbox links, in der Nähe der Startbox Tür und stoppen Sie den ersten Timer.
8. Rekord von Hand den Pfad der Maus bewegt, wie es das Labyrinth navigiert. Eine Maus geht in eine neue Zone oder den Arm des Labyrinths, wenn alle vier Pfoten sind in diesem Bereich überschritten (siehe Abb. 1)..
9. Wenn alle vier Pfoten das Ziel Feld eingeben, schließen Sie die Tür, die zwischen dem Irrgarten und das Ziel ein und stoppen die zweite Stoppuhr.
10. Wenn die Maus vollständig in den pseudo-home Käfig trat, schließen Sie die Tür zwischen dem Ziel-Box und den Käfig. Stoppen Sie die dritte Stoppuhr.
11. Notieren Sie die Zeiten aus den drei Stoppuhren. Zählen Sie die Anzahl der Fehler mit der Maus gemacht hat. Ein Fehler wird als Einstieg in eine Sackgasse Cul-de-sac Zone definiert (zB Übergang von Arm L, die Zone K;. Abb. 1) oder eine Zeitreise durch ein bereits gereist Arm des Labyrinths (zB Übergang von Arm zu Arm F C; Abb. 1).. Während wir mit der Maus, da er mit auftritt Score ist es möglich, auf Videoband aufzeichnen oder auf andere Weise Labyrinth-Studien für nachfolgende Scoring entweder mit blossem Auge oder durch automatisierte Software zu ermöglichen. Experimenter Ermessen sollte verwendet werden, um eine geeignete Methode zu wählen.
12. Lassen Sie das Tier in der pseudo-home Käfig für 1 min vor der Rückgabe an seinen eigenen Käfig.
13. Wiederholen Sie die Schritte 2,3 bis 2,12 für alle Mäuse im Test Kohorte.
14. Wenn die letzte Maus in der Kohorte in seinen Heimkäfig zurückgegeben wurde, beginnen die 30 Minuten-Timer. Am Ende dieser 30 Minuten Zeit, wieder Nahrung und Wasser für alle Mäuse in der Kohorte und dann wieder die Tiere, um ihre Kolonie Raum.
15. Wiederholen Sie diesen Vorgang an aufeinanderfolgenden Nächten, mit einem Versuch pro Testtag pro Tier, bis alle Mäuse in der Kohorte eine definierte Lernen Kriterien erreicht haben, oder bis eine vorgegebene nUmbra von Testversuchen ist aufgetreten. Eine Maus ist so gelernt haben das Labyrinth, wenn es die Aufgabe mit 0 oder 1 error (s) durchführen können an zwei aufeinander folgenden Studien klassifiziert. Mäuse sind in der gleichen Reihenfolge an aufeinanderfolgenden Studien getestet.

3. Repräsentative Ergebnisse:

Tage zu lernen (REACH-Kriterium) können analysiert und verglichen werden zwischen den verschiedenen Gruppen in einer bestimmten Studie (Abb. 2A und 3A). Darüber hinaus kann ein Lern-Index (Lern-Verhältnis), das Labyrinth Übernahme kennzeichnet, in den ersten vier Tagen der Testphase (Abb. 2b und 3b) ausgewertet werden. Die Lern-Index ist das Verhältnis der Anzahl der richtigen Pfadsegmente gereist, um die Gesamtzahl der Pfadsegmente reiste für jeden Versuch. Die durchschnittliche Lern-Index sollte etwa 0,5 für Versuch 1, wenn die Mäuse zunächst das Labyrinth ausgesetzt und die Navigation durch Zufall. Die Lern-Index steigt und Ansätze 1 zwischen 2 und 4 Studien darauf hinweist, dass das Lernen stattfindet. In Abbildung 2 jungen (2 Monate) und Alterung (24 mo) männlich C57Bl/6NCr Mäuse wurden auf dem Lashley Labyrinth für bis zu 15 Studien geschult. Die jungen Mäuse lernten das Labyrinth in 7,2 (± 1,5) d. Im Gegensatz dazu nahm die alternden Tieren 11,7 (± 2,1) d Kriterium zu erreichen. Es gab einen starken Trend zur Alterung C57Bl/6NCr Mäuse länger dauern, bis das Labyrinth ([t (23) = 1,59, p = 0,056] zu lernen; einseitigen t-Test, a priori Hypothese, dass die Tage zu lernen mehr in alternden Mäuse). Wenn das Lernen Index berechnet wird, zeigen die beiden Altersgruppen einen stetigen Anstieg in den Lern-Index aus Studien 2 bis 4 (signifikanter Haupteffekt der Zeit P <0,001). Allerdings gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Lern-Index zwischen jungen und alten Mäusen C57 C57-Mäuse (Haupteffekt Alter von P = 0,58).

Abbildung 3 ist repräsentativ für Studien, die die Auswirkungen der Hintergrund Belastung auf das Lernverhalten. Daten aus der jungen männlichen C57Bl/6NCr in Abb.. 2 sind nun die Daten aus jungen Crl Vergleich: CD-1 (ICR) BR-Mäusen [CD-1, 4-5 mo]. CD-1 Mäuse lernten die Lashley III Labyrinth in 4,5 (± 1,4) d, jedoch gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Stämmen in Tagen zu erlernen (Abb. 3A; [t (18) = 1,328, P = 0,20], zwei -tailed t-Test). Dagegen hat die Prüfung des Lernens Index zeigt, dass, während alle Tiere wurden Navigation durch das Labyrinth auf dem ersten Versuch durch Zufall erfuhr CD-1 Mäusen die Aufgabe schneller (Haupteffekt der Stamm P <0,001). Dies ist bedingt durch die statistisch signifikante Erhöhung der Lern-Index in Studien 2 bis 4 in CD-1 Mäusen im Vergleich zu C57Bl/6NCr Mäuse dargestellt. Interessanterweise, wenn CD-1 Mäuse in das Labyrinth über den Punkt zu erreichen Kriterium geschult werden weiterhin zeigen sie das Verhalten Anzeichen für Übertraining (Abb. 4), die im Folgenden näher eingegangen wird.

Abbildung 1:. Die Lashley III Labyrinth Die Sackgasse Cul-de-sac Zonen des Labyrinths sind rot in diesem Diagramm lediglich zu illustrativen Zwecken. Die Basis und die Arme des eigentlichen Labyrinth sind Uni-Farben (kleines Bild). Das Labyrinth ist maßstabsgetreu (Abmessungen im Text).

Abbildung 2: Lashley III Labyrinth Leistung in 2 und 24 Monate alten männlichen Mäusen C57Bl/6NCr Die Lashley III Labyrinth wurde benutzt, um zu beurteilen Route Lernen in jungen (2 Monate) und Alterung (24 mo) männlich C57Bl/6NCr Mäusen.. Die gemessenen Parameter waren (a) Tagen Kriterium, die Anzahl der Tage für eine Maus, um das Labyrinth für zwei aufeinander folgende Nächte laufen mit 0 Fehlern oder 1 Fehler erforderlich ist, und (b) Lernen Index, die Anzahl der richtigen vier Pfoten Arm Einträge gemacht im Vergleich zu der Gesamtzahl der Arm Einträge an den Tagen 1-4 von Lashley III Labyrinth Test gemacht. Anzahl der Tiere pro Gruppe wurden n = 10 für 2 Monate alt und n = 15 für 24 Monate alten Mäusen.

Abbildung 3: Lashley III Labyrinth Leistung bei jungen männlichen C57Bl/6NCr und CD-1 Mäusen Die Lashley III Labyrinth wurde zur Strecke zu bewerten Lernen in 2 Monate alten C57Bl/6NCr und 4-5 Monate alten CD-1 Mäusen.. Die gemessenen Parameter waren (a) Tagen Kriterium, die Anzahl der Tage für eine Maus, um das Labyrinth für zwei aufeinander folgende Nächte laufen mit 0 Fehlern oder 1 Fehler erforderlich ist, und (b) Lernen Index, die Anzahl der richtigen vier Pfoten Arm Einträge gemacht im Vergleich zu der Gesamtzahl der Arm Einträge an den Tagen 1-4 von Lashley III Labyrinth Test gemacht. Anzahl der Tiere pro Gruppe wurden n = 10 für C57Bl/6NCr und n = 10 für CD-1 Mäusen. Statistische Signifikanzen: * P <0,05, ** P <0,01 im Vergleich zu C57Bl/6NCr Mäusen.

Abbildung 4: Lashley III Labyrinth Leistung in 4-5 Monate alte männliche CD-1 Mäusen Die Lashley III Labyrinth.wurde verwendet, um zu beurteilen Route Lernen in zehn 4-5 Monate alte männliche CD-1 Mäusen auf 15 aufeinander folgenden Tagen. Die gemessenen Parameter waren (a) Anzahl der Fehler pro Tag, mit einem Fehler als ein Vier-Pfoten-Eintrag in eine Sackgasse Cul-de-sac-Zone oder auf Reisen ein bereits gereist Arm des Labyrinths definiert, und (b) Zeitaufwand in das Labyrinth pro Tag. Der Tag, an dem Kriterium erreicht wurde ist mit einem roten Pfeil gekennzeichnet.

Die am häufigsten verwendeten Nager Verhaltenstests für Lernen und Gedächtnis zu bewerten sind die Morris Water Maze und Varianten Angstkonditionierung ^2. Diese Tests basieren auf visuelle oder auditive Signale für das Lernen und aversive Reize (z. B. Wasser, Fußschock) für Tiere, zu motivieren, die Aufgaben ³ abgeschlossen. In alternden Nager, wie im alternden Menschen, Rückgang sensorischen Modalitäten über die Zeit. Mehrere Hintergrund Mäusestämmen ihr Gehör verlieren oder zu entwickeln, Katarakte, da sie alt, und die Sterblichkeitsrate nach 23,5 h Wasser Entbehrungen haben gezeigt, dass bei Mäusen zu erhöhen, als sie ⁴ Jahre. So können Änderungen in der Leistung in diesen mehr weit verbreitete Tests schwierig sein, in alternden Nagetiere zu deuten.

Die Lashley III Labyrinth wurde zuerst von Karl Lashley 1929 ⁵ beschrieben. Lashley verwendet dieses Paradigma für das Gedächtnis Engramm in der Hirnrinde mit kortikalen Läsion Techniken zu suchen. Wir haben etwas die ursprüngliche Labyrinth modifiziert, um für die breite Anwendbarkeit auf Studien mit Alterung Nager ermöglichen. Wir haben Lebensmittel-cued Navigation des Labyrinths beseitigt und gezeigt, dass eine pseudo-home Käfigumgebung ausreichende Motivation bietet sowohl jungen und alternden Mäusen, um das Labyrinth ¹ Ebene. Andere Forscher haben auch eine Lebensmittel-Pellet Belohnung zur Erleichterung des Lernens der Lashley III Labyrinth ⁷ genutzt. Optisch-cued Navigation, wie in der Morris Water Maze und der Barnes kreisförmige Labyrinth erforderlich, wurde ^2,6,8 minimiert. Mäuse sind keine Nahrung beraubt zu 90% ihres Körpergewichts, wie es für die verschiedenen Varianten der radialen Arm Labyrinth, Y-Labyrinth und T-Labyrinth Aufgaben ^2,9-10 erforderlich. Vielmehr ist Nahrung und Wasser zur Verfügung zu Tieren ad libitum und ist nur 30 min vor jedem Test-Studie mit Tests in der Regel statt während der aktiven dunkle Phase entfernt. Das Essen ist 30 min nach der letzten Maus in einer Kohorte wieder beendet die Aufgabe und dissoziiert zeitlich von der Rückkehr in die pseudo-home Käfig, um nicht als eine offene Belohnung für den Abschluss der Aufgabe zu handeln. Wichtig ist, dass Nichtverfügbarkeit von Nahrung und Wasser für die gesamte Kohorte nicht über einen Zeitraum von 4-5 h pro Versuch zu verlängern. Darüber hinaus sollten Mäusen, die verschiedene experimentelle Gruppen zusammen auf dem gleichen Nächte getestet werden.

Die Modularität des Lashley III Labyrinth ermöglicht Modifikationen entwickelt, um verschiedene Aspekte des Lernens Retention Test. Zum Beispiel, während die Erfassung erfolgt mit dem Labyrinth in einer bestimmten Konfiguration, einmal Akquisition etabliert ist, das Labyrinth kann gedreht werden, so dass die Mäuse in die entgegengesetzte Richtung, um die Aufgabe, dh vollständige Umdrehung muss, werden die Mäuse nach rechts kommen aus der Startbox erfolgreich dem Irrgarten zu entkommen während der Akquisition, sondern Flexibilität des Lernens (Recall) kann durch Drehen des Labyrinths, so dass die Mäuse aus muss der Startbox für eine erfolgreiche Navigation links gemessen werden. Weitere Varianten des Prüfverfahrens sind über das Lernen für einen festgelegten Zeitraum (in der Regel 14 d) und dann so eine Verzögerung im Abstand von mehreren Wochen nach der Speicherung von maze Lernen gemessen wird. Retention Abständen müssen vom Piloten Arbeit aufgebaut werden und sind study-/strain-dependent. Längere Trainingseinheiten neigen dazu, mit längerer Verweildauer Abständen in Verbindung gebracht werden. Änderungen der Lashley III Labyrinth Verfahren selbst beinhalten das Hinzufügen Geruch Cues oder Lärm Impulse für zusätzliche Motivation für eine erfolgreiche Labyrinth Navigation. Stressfaktoren wie Zurückhaltung Stress kann zu verschiedenen Zeiten angewendet werden vor, während oder nach dem Erwerb zum zustandsabhängigen Lernen und Gedächtnis zu untersuchen.

Ein wichtiger Faktor bei der Umsetzung der Lashley III Labyrinth ist die Dauer der Ausbildung Intervall. Die meisten verfügbaren Stämme von Inzucht und outbred Mäuse, einschließlich C57Bl / 6, Swiss Webster und BXD rekombinanten Inzucht-Mäusen, die das Lernen Kriterium innerhalb von 14 Tagen zu erreichen. Einige Stämme, vor allem CD-1 Mäuse, erreichen Kriterium nach nur 7 Tagen. Übertraining einiger Stämme von Mäusen produziert abweichendes Verhalten in dem Labyrinth, wird dadurch gekennzeichnet, dass Mäuse fangen an einem stetigen und raschen Anstieg der Zahl der Fehler pro Versuch und Zeit erkunden das Labyrinth gemacht zu zeigen. Abbildung 4 ist repräsentativ für Übertraining in 4-5 Monate alte männliche CD-1 Mäusen. Nach dem ersten Kontakt mit dem Labyrinth, Institut haben wir einen 15 min cut-off period pro Versuch für jede Maus. Nach 15 min wird die Maus durch das Labyrinth der pseudo-home Käfig geführt und Fehler werden nicht gezählt, wenn die 15 min Marke erreicht wurde. Wenn mehrere Mäuse in einer Kohorte oder in einer größeren Studie, um durch das Labyrinth nach Erreichen Lernen Kriterien geführt werden müssen, kann dies ein Anzeichen von Übertraining. Um dies zu umgehen Probleme mit Übertraining und die gesamte Testdauer zu verkürzen, haben wir die Akquisitionsphase zu vier Versuche in einigen Studien begrenzt, und im Durchschnitt des Lernens Index aus der dritten und vierten Versuche zu einer Lern-Score zu bestimmen. Dieses Lernen Gäste können an Stelle der verglichen werdenTage, um zu lernen.