从外植体生长的首要人权支气管上皮细胞

人支气管段原发性支气管上皮细胞提供了一个丰富的源泉。在这篇文章中，我们描述一个人支气管上皮细胞（HBE）的新鲜分离的人支气管段的增长和扩张的协议。该协议包括五个部分：

1. 涂料和刮伤100毫米培养板
2. 准备支气管组织植
3. 支气管组织移植
4. HBE细胞传代
5. Transwells纤毛HBE细胞成长

开始之前 ，所有步骤都在生物安全柜（BSC）除非另有说明，进行注。请确保您有此过程所需的所有材料。请阅读的材料，试剂和准备部分，并确保您已在无菌条件下（即在生物安全柜或BSC）准备以下：
涂层原液：纤维连接蛋白（10微克/毫升），牛血清白蛋白（10微克/毫升）和胶原厄尔s平衡盐溶液（30微克/毫升）（EBSS，无菌）。
培养基：添加剂，抗生素antimycotic（1％）和胎牛血清的DMEM /火腿架F - 12（1％）
解离的解决方案：胰蛋白酶/ EDTA原液和胎牛血清DMEM/F-12（10％）

1。涂料和刮伤100毫米培养板 ：将镀在百毫米培养皿中植。开始涂层涂液100毫米培养皿。这项工作应在BSC，把一切都无菌。

1. 广场的无菌百毫米培养板在BSC和涂料溶液（胶原蛋白/纤维连接蛋白/ BSA）。
2. 移液器2.0毫升的涂层解决方案，在一个100mm的钢板。
3. 旋流周围涂层板基地。确保涂层解决方案涵盖的板块基地均匀。
4. 移液器剩下的解决方案，并用它来涂第二百毫米盘。许多板块需要重复。组织植板的数量随。
5. 确保涂层解决方案覆盖均匀地展示板块基地。
6. 其涵盖的覆盖板。允许板干燥1-2小时，在孵化器吸出多余的溶液使用前支气管组织植。未使用的涂培养板，可放置在无菌袋密封，并保存在4 ° C，供以后使用（可以储存在冰箱一个月）。置于室温后方可使用。
7. 喷雾用70％乙醇清洁锋利的小剪刀，手术刀，镊子，把平衡计分卡。刮涂层钢板，按用手术刀牢固地形成深小X S（至少4个）。如果从头不够深入，组织块不会成脊解决，将浮动。

2。准备支气管组织植

使用支气管组织，手术后24-36小时内获得。继续组织EBSS冰，直到准备使用。

1. 外BSC：放置在培养皿中的组织。在EBSS彻底冲洗孤立的人支气管组织标本。
2. 解剖出多余的周围组织。
3. 剖开支气管件。
4. 带入了BSC和转移到无菌百毫米组织培养板，冷DMEM/HamF12组织+ 1％的抗生素/ antimycotic。
5. 使用锋利的小剪刀切成2-3毫米^的3块组织。
6. 放置在每一个X中心的一块切组织用镊子轻轻按压。
7. 让组织块（植）坚持板块几秒钟，然后轻轻地添加10毫升完整的媒体（DMEM/HamF12 +添加剂1％，抗生素/ antimycotic + 1％FBS）。如果组织后加入媒体花车，用钳推入了X脊组织或一个新的X如果脊不够深，可能有必要做出新的X秒。
8. 每隔3-4天孵化器和改变介质板。
9. 组织准备好足够的上皮细胞移植时，组织外植体周围种植覆盖1 - 2cm的地区。这大约需要4周时间。

3。支气管组织移植

1. 使用100毫米涂层和划伤板。由于一些组织外植体可能不会成功，板块的数量取决于你如何组织多件是移栽。如果您使用的是先前已经涂层和保存在4 ° C的板，带至室温后方可使用。
2. 使用镊子，小心地拿起从原板，并在新盘的中心，在X秒的地方组织，并轻轻按压。没有生长的组织应该被丢弃。
3. 让组织坚持了几秒钟，以板，添加媒体和孵化所述耳李耳为外植体（2.7-2.9）。

4。人支气管上皮细胞（HBE）的袭

1. 每100mm组织培养板解冻的胰蛋白酶/ EDTA股票解决方案2毫升。无菌0.01M PBS6毫升稀释股票（即添加2毫升原液至6 ml PBS（胰蛋白酶终浓度为250μg/ ml和EDTA是100微克/毫升）。
2. 植到一个新的板块移动后，吸板有1 - 2cm的细胞环的媒体。
3. 添加回暖稀释胰蛋白酶/ EDTA溶液8毫升每100mm板，在孵化器（37℃）为3-15分钟。经常检查，离开时间过长会损坏细胞的胰蛋白酶。
4. 板在显微镜下检查，以确保大部分细胞已被取消。细胞将轮和分离，如图所示。
5. 添加媒体在每盘的回暖，10％胎牛血清的8毫升灭活胰蛋白酶/ EDTA溶液。
6. 组合成一个管（或单独管，如果有不同的组织）的所有板卷。使用hemacytometer计数细胞。
7. 在100克离心5分钟。一个细胞沉淀形成管基地。
8. 重新挂起完整的媒体颗粒细胞（+所有添加剂1％，抗生素antimycotic + 1％胎牛血清的DMEM /火腿F12）所需的细胞浓度。
9. 广场2-3万每T75烧瓶每个细胞，并根据需要添加完整的媒体。培育和改变媒体的每3-4周。细胞生长分合流T75烧瓶中，在约4周（80-90％）。应解除扩大或分合流，以防止衰老的细胞。

5。生长在Transwells纤毛人支气管上皮（HBE）的细胞 。

基层组织的外植体/移植种植的上皮细胞，可扩充至三倍，然后使用。一个5万至10万每平方厘米²细胞的播种密度是^建议 1,2 。更高的密度，促进更快的分化。
注意：准备一个细胞悬液，并测量它们的数量。重悬在1万元左右2毫升细胞培养基。

1. 开始预孵化与细胞培养插入培养基（DMEM培养液/ HAM F12）使用前准备transwells渗透膜。这一步是必要的 ， 与这些敏感的细胞 ，将有助于细胞的附着。
   1. 使用6.5毫米插入适合，以及24多个孔板。
   2. 添加介质膜的两侧（6.5毫米插入使用0.6毫升的底部，顶部0.1毫升）。在细胞培养孵化器孵育1小时。
   3. 小心地取出（吸）首先与基础卷膜两侧的介质。
      仔细手段：膜可以很容易损坏，所以方文化插入吸管向下中期，建议使用量。不这样做将导致介质泄漏到其他井的。
2. 透水支持预培养后的种子细胞
   1. 仔细移液器到心尖侧膜细胞悬液：6.5毫米井膜的顶端加入0.1 ml的细胞悬液（即50,000个单元格）。
   2. 移液器0.6毫升介质膜基底。
3. 饲料从10天的心尖和基底双方细胞，建立一个分化良好的文化：交换媒介，每周​​两次使用方法说明：
   1. 删除基底销量第一
   2. 更换根尖卷（0.1毫升中等）
   3. 添加0.6毫升介质膜的基底侧。
   
   这种方法促进细胞附着到细胞膜和防止细胞被暴露在空气中很长一段时间（交换媒介迅速把孵化器回）。
4. 创建取出根尖介质10天的气 - 液界面（ALI），然后替换基底侧膜液0.6毫升。
5. 维持6个星期在阿里的细胞，改变媒体每周两次。纤毛细胞会开始出现建立在ALI后4个星期。细胞将实现统一的分化成纤毛细胞，6周后，在ALI创造。

准备材料：

1。涂层联合解决方案的准备（在BSC ）：

初级人类支气管上皮细胞生长良好，与纤维连接蛋白/ BSA /胶原蛋白³涂层表面。涂层原液用于100毫米组织培养皿上文所述外植体和移植文化。也涂层解决方案可用于大衣盖玻片，加快细胞附着，盖玻片，然后利用免疫实验。

1. 纤维连接蛋白（1mg/ml的原液）：使用自Sigma F2006 - 2毫克 。溶解在无菌厄尔s平衡盐溶液（EBSS，Sigma公司28888），与0.2微米的生物安全柜（BSC）的注射器过滤过滤器2mls 2毫克。商店1毫升在-20℃冷冻供日后使用，使用准备的涂层解决方案，100毫升1毫升。
2. BSA（1mg/ml的原液）：Sigma公司A4919 - 1G使用 。称取BSA和20毫克，溶于20毫升无菌EBSS，与0.2微米的注射器过滤器在BSC过滤器。到1毫升小瓶分装，储存在-20 ° C冰箱，直到需要。使用股票1ml到涂层解决方案100mls。
3. 胶原蛋白原液（0.1％或自Sigma C8919 1mg/ml的提供）注：只在BSC和密封紧，然后再返回到冰箱打开。使用3毫升股票，使涂液100毫升。
4. 涂层股票的解决方案 ：在BSC：添加3mls胶原蛋白（1mg/ml的）1毫升纤维连接蛋白（1mg/ml的）和1毫升牛血清白蛋白（1mg/ml的），加95毫升EBSS（无菌）。混入2 mL样品瓶和储存在-20 ° C冰箱和分装，直到需要。最终浓度在涂层原液：纤维连接蛋白（10微克/毫升），牛血清白蛋白（10微克/毫升）和胶原EBSS（30微克/毫升）。

2。制备培养基（准备在BSC）：中包括来自Sigma的DMEM /火腿架F - 12与牛垂体提取物（15微克/毫升）和表皮生长因子（10毫微克/毫升）与其它添加剂如下所示。抗生素/ antimycotic（1％）和FBS（1％），加入新鲜培养基改变时。这种介质被编译检讨描述呼吸道上皮细胞培养^3-9的多种方法。我们的媒介是用于人支气管上皮细胞的最佳生长。

1. 牛垂体提取物（BPE 1mg/ml的原液）：Sigma公司P1476（14mg/ml消毒和过滤解决方案2.5毫升BPE）：稀释2.5毫升的股票（14mg/ml）至终浓度为1mg/ml 。例如，添加2.5毫升BPE股票32.5毫升无菌EBSS为1mg/ml的股票。分成7.5毫升分装（4管7.5毫升分装和一个5毫升分装管）。稀释后，在-20 ° C存储等分，直到需要。不建议长期储存，重组产品和反复冻融。
2. 表皮生长因子（EGF的10微克/毫升的原液）：西格玛E9644 - 0.2mg的。重组在20毫秒为0.2毫米过滤10毫米醋酸的含量（0.2mg的），含0.1％BSA（即BSA和20毫克，溶于20毫升10毫米醋酸，过滤器，然后使用重组表皮生长因子）。分装到0.5毫升分装在-20℃冷冻储存。使用100毫升媒体100μL。
3. 肾上腺素（5mg/ml原液）：西格玛E1635。溶解在2毫升1M过滤盐酸（HCl），分装成50μL小瓶和冻结（-20℃）10毫克。
4. 胰岛素（2mg/ml原液）：Sigma公司I6634 50毫克。 25毫升过滤（0.2微米的过滤器）稀盐酸（1mm）的溶解50毫克。 1.25毫升小瓶分装成。
5. Tranferrin人（50毫克/毫升的原液）：Sigma公司 T8158 100毫克。溶解在2毫升DH20 100毫克（0.2微米的过滤器过滤）。分装到100μL每个0.5毫升小瓶。
6. 三碘- L -甲状腺素（1mg/ml的原液）：Sigma公司T6397 100毫克。 100毫升1M过滤盐酸溶解在100毫克。分装成1毫升等份。分装成加入10μl等份0.5毫升。
7. Hydorcortisone（5mg/ml原液）：西格玛H0888称取100mg和20毫升过滤乙醇溶于5mg/ml股票。到1毫升小瓶分装。除以一个1毫升（5mg/ml）50μL等份（0.5毫升瓶）。
8. 维甲酸（1mg/ml的原液稀释至0.01mg/ml使用时）：西格玛R2625 100毫克）。溶解在乙醇10毫升中的100毫克。分1.0毫升等份。 DIVIDE（1毫升）50管20μL每个小瓶。冻结在-20 ° C。 20μL一小瓶，需要时，媒体为0.01mg/ml股票稀释到2000μl。
9. 从牛血清，无菌过滤，细胞培养的白蛋白溶液测试 ：西格玛A8412 。在寒冷的存储解决方案（4 ° C），直到所需要的。打开只在BSC。
10. 抗生素Antimycotic，适马A5955：等分至1ml卷，并在-20 ° C，直到需要的冻结。在1％终浓度的介质中使用。
11. 胎牛血清，西格玛F1015：关闭 FBS在50 ° C下30分钟。允许在BSC冷却。 1毫升和10毫升的无菌小瓶分装成。在培养基中的终浓度1％和10％终浓度在媒体使用中胰蛋白酶/ EDTA溶液。
12. 宪法的培养基：
    对于500毫升的中型DMEM/HamF12使用：
    • 1管的BPE（每1mg/ml的7.5毫升）的终浓度为15μg/ml。
    • 1管的终浓度在10ng/ml EGF（10μg/ml0.5毫升）。
    • 1管肾上腺素（5mg/ml50μL）的终浓度为0.5μg/ml。
    • 1小瓶胰岛素（2mg/ml1.25毫升）的终浓度5μg/ml。
    • 1瓶Transferin（50mg/ml100μL）的终浓度为10μg/ml。
    • 5μL的三碘- L -甲状腺素（在1mg/ml的）的终浓度在10ng/ml。
    • 1小瓶氢化可的松（5mg/ml50μL）的终浓度为0.5μg/ml。
    • 5维甲酸液稀释至0.01mg/ml的终浓度为0.1ng/ml。
    • 10μL牛血清白蛋白溶液的终浓度为1.5μg/ml
    将7.5毫升的BPE原液500毫升的无菌瓶，并添加上述所有添加剂。化妆用DMEM /火腿架F - 12到500毫升。存储解决方案在冰箱密闭和避光。当需要时，以取代板，只有等份所需的培养基和添加新鲜抗生素antimycotic（1％）和FBS（1％），升温至37 ° C，然后使用。

3。分解方案的筹备工作：

1. 胰蛋白酶/ EDTA原液的制备方法 ：100毫克胰蛋白酶（Sigma公司T9935 - 100毫克）和40mg EDTA（Sigma公司E6758）溶于500毫升0.01M PBS（Sigma公司E6758 ）。到2毫升小瓶分装，并储存在-20 ° C冰箱稀释原液加2 ml原液至6 ml PBS（胰酶的最终浓度为250微克/毫升EDTA和100微克/毫升） 。
2. 阻止酶反应的解决方案 ：在BSC媒体准备好新鲜的10％FBS：添加1毫升胎牛血清至9毫升媒体（DMEM / HAM的F - 12 ）。对于每100mm板使用8毫升回暖10％胎牛血清中8毫升的解离解决方案。

4。特殊要求：

1. 上皮细胞培养时，你需要保留一切清洁和消毒。细胞培养中使用的所有试剂应无菌或过滤0.2μm的过滤器。材料和添加剂的制备应在生物安全柜（BSC）。媒体增加或改变媒体应该做的学士学位。
2. 头发远离领带，戴上一次性帽，如果有，并穿实验室外套和手套。
3. 保留所有的工作表面杂乱。清洁工作表面与操作之间的乙醇70％，并允许至少15分钟处理不同文化之间的。
4. 标签的所有媒体的试剂和瓶子，包括收到的日期和日期准备。
5. 定期检查文化和媒体总值的细菌或真菌污染的证据。
6. 支原体定期测试（如果需要）
7. 培养基预热至37℃前改变细胞的媒体。
8. 抗生素/ antimycotics和FBS应新鲜添加到中等。
9. 更改介质至少每3-4天。不要让细胞在室温下长时间坐在。更改媒体，并及时返回到孵化器。

代表性的成果：

文化的特点和人支气管上皮细胞的形态

显微镜证明刷的文化支气管段，前培养的人支气管上皮细胞，纤毛和非纤毛上皮细胞，表明正常的上皮细胞（图1，补编1 ）条。 cytospin准备植透露盖玻片种子细胞的细胞免疫染色，所有的细胞为上皮细胞角蛋白（ 图 3）积极。 8 9组织发生来自支气管组织的外植体的成功文化，作为外植体培养的人受到感染。上皮细胞环达1-2厘米半径在3-4周（ 图2a）。成功的外植体培养的6倍。在所有成功的文化，开始移植（ 图2b）48小时内细胞迁移的证据。细胞有一个鹅卵石的外观，这些上皮细胞在图2，4，5和6所示的是不同的。小组培养的支气管细胞细胞角蛋白和E - cadherin的阳性表达呈均匀。由成纤维细胞特异性抗体对其他类型的细胞免疫没有任何文化的污染迹象，mesenchymal，或内皮细胞（α- SMA，波形蛋白和CD31：PECAM - 1污渍分别）（ 图5）。渗透聚酯膜（transwells）与气液界面如图6所示分化成纤毛上皮细胞培养。代表transwells增长的支气管上皮细胞的录像显示， 与纤毛（增刊2）击败了差异上皮。

人支气管上皮细胞测试文化的特征见表 1 。第一通道（P1）的平均时间是4周，平均产量为15.1 ± 2.75万个单元格（N = 9个组织）。台盼蓝拒从外植体，并在P1细胞的可行性进行了评估，并且是一贯的高（99％），在这些支气管文化。小组培养的细胞从植从每个组织的文化汇集后供日后使用第一通道。从外植体回收的平均细胞数显着比随后通过文化（从P1每2万细胞产生的P2：6.75 ± 2.4万个单元格，N = 5的组织）。一个P2文化被丢弃的形态不典型的上皮细胞（ 图7a）。同样，两个不同的组织（ 图7b）（P2和P3）其他段落被丢弃。

图1人类支气管组织部门和新鲜分离上皮的纤毛和非纤毛细胞地带。 （一）人类支气管组织部门的代表图片 - 〜1 - 2cm长的原代培养的人支气管上皮细胞的直径<1厘米使用。 （二）从支气管段刷的人支气管上皮细胞的地带演示纤毛和非纤毛上皮细胞，放大倍率320X。视频跳动纤毛细胞提供补充1。

图2人支气管上皮细胞生长100MM组织培养板植。 A）100毫米板23立方毫米组织。注意环约1 - 2cm的细胞变得3-4周后肉眼可见。 B）外植体组织和上皮细胞边缘的图像，因为他们从外植体，酒吧=100μm的迁移。外植体转移到一个新的板块成为移植。植，可移植到6倍。

图3为特定的上皮细胞角蛋白染色外植体培养的细胞。 Cytospins从外植体细胞染色细胞角蛋白（绿色）与抗泛细胞角蛋白FITC（混合物）承认人类细胞角蛋白1，4，5，6，8，10，13，18，和19。细胞核用Hoechst染色染色（蓝色）。合并后的图像表明，支气管细胞从外植体生长的主要是上皮细胞，酒吧=20μm的。

图4人支气管上皮细胞的亚文化。 a）用胰蛋白酶/ EDTA，被取消，从外植体和移植细胞为100mm板，计数和种子在2-3万个细胞T75烧瓶。细胞生长分合流T75烧瓶中，在28-30天（80-90％）（B，C）。注意典型的鹅卵石形态的上皮细胞，酒吧= 100微米。

图5个子培养支气管细胞上皮使用免疫核实。这些细胞染色阳性细胞角蛋白- FITC（A，B），细胞角蛋白- FITC的阳性对照是在A549上皮细胞（C）和成纤维细胞（D）阴性对照证明显示（绿色）。培养支气管细胞染色阳性（暗红色）E-Cadherin/Alexa福陆公司的594（I，J），并没有对α- SMA - CY3（E，F），波形蛋白/ TRITC（M），也不CD31（PECAM污点-1/FITC）（O）表示没有平滑肌，间质或血管内皮细胞的原代培养的支气管上皮细胞的污染。阳性（暗红色）E-Cadherin/Alexa福陆公司的594的控制是表现出对A549上皮细胞（K）。 α- SMA Cy3标记（红色），阳性对照，表明在成纤维细胞（G，H）。二级抗体控制在支气管上皮细胞的Alexa Fluor 594（L）;兔抗鼠TRITC（N）和驴抗山羊FITC（P）。酒吧=20μm的。

图6 transwells培养的人支气管上皮细胞。在播种密度50000 CEL纤毛细胞培养渗透聚酯膜（6.5毫米直径）每口井的LS（一）酒吧= 100微米。与细胞角蛋白- FITC（绿色）和DAPI transwells培养的细胞免疫染色（蓝色）表明，这些细胞主要是上皮细胞，酒吧=20μm的。细胞培养淹没在为期10天的媒体，从底部只为4-6周，然后美联储的媒体创建一个ALI的，直到纤毛生长在（B），放大倍率160倍，如图所示。 补编跳动纤毛视频2。 （C）透射电子显微镜图像显示在6个星期的纤毛ALI的文化增长，放大倍率= 150000x。

图7例，根据形态，应该抛弃的细胞。这些细胞通常会出现当组织被移植了很多次。需要注意的是细胞和移植应被丢弃。 A）细胞收集与培养的6倍，在T75烧瓶镀板移植。 1个星期内的细胞表现出不同的形态，并不代表上皮细胞的鹅卵石外观。相反，薄拉长细胞生长密集。 B）不应该汇集与典型的上皮细胞的细胞更多的例子，但应该被丢弃。酒吧= 100微米。

表1：人支气管上皮细胞培养的特征

补充1显示了一个刷从人体器官移植中使用的支气管段支气管上皮细胞纤毛和非纤毛的地带，放大倍率320X 。点击这里为补充1视频。

补充2区分支气管上皮细胞生长气-液界面上。视频（2a和2b）分别击败纤毛，放大倍率160X和320X。 点击这里为补充2A视频。 点击这里为补充2B视频。

在这项研究中，我们提出了详细的文化和扩大初级人支气管上皮细胞的方法。我们演示了如何植和支气管组织，促进上皮细胞生长的媒体培养，移植可以提供连续无差异（淹没）和差异（气 - 液界面上的）的细胞模型研究了人类呼吸道上皮细胞源。在药物检测系统，更接近其真正的生理环境中的细胞，这些细胞可以利用。这是非常重要的，你看从植/移植的细胞生长，并确认的鹅卵石形态。如果细胞表现出不同的的形态，弃细胞和植/移植，并继续只移植成功组织。 ALI的文化在我们手中需要较长的时间要建立比以前报^2。这可能是改变媒体在ALI隔日可能更快地促进纤毛上皮细胞的分化和成长。

我们希望这里所描述的方法会鼓励你培养的人支气管上皮细胞从植，并使用这些细胞在你的学习制度。毕竟，人体细胞的基础研究，为确定人类肺癌发病机制的重要途径和发展的需要，导致早期评价和新药的成功率， 更好地人体细胞的体外毒性和药效筛选细胞为基础的。