Имплантация Ferumoxides Маркированный мезенхимальных стволовых клеток человека в Дефекты хряща

1. Маркировка hMSCs с Endorem

1. Клетки выращивают до 80% слияния по крайней мере за 18 часов до маркировки.
2. За это время, маркировка СМИ получают путем добавления Endorem к образцу в дозе 100 мкг Fe / мл сыворотки среде.
3. После клетки выращивают до слияния, питательных сред отсасывают и клетки промывают 1x с PBS или сыворотки среде.
4. Далее, промывочный раствор отсасывают и ранее подготовленный СМИ маркировке добавляется. Затем клетки инкубировали при 37 ° C, 5% СО ₂ в течение 4 часов.
5. После инкубации в 4 часа, маркировка СМИ отсасывают и клетки промывали PBS и трипсином, как обычно.
6. После трипсином, клетки промывают 3 раза с PBS и центрифугировали при 400rcf течение 5 минут.
7. После этой промывки, клетки ресуспендируют, считая, оцениваются на жизнеспособность, и используется по мере необходимости для экспериментов.

2. Подготовка агарозном

1. После клетки были помечены пришло время приготовления раствора агарозы.
2. На мелкого масштаба, 80 мг агарозы порошка взвешивают и добавляют в 2 мл PBS.
3. Это решение затем слегка встряхивают и автоклавировать.
4. Примерно через 40 мин, жидкий раствор агарозы может быть выведена из автоклава. Объем должен быть измерены и соответствующим образом скорректированы с разогретой PBS.
5. Затем раствор охлаждают до 42 ° C

3. Создание MASI

1. Когда раствор агарозы достигла нужной температуры, клетки подсчитываются и центрифугировали в течение последнего времени в трубку 1,5 мл Eppendorf.
2. После центрифугирования супернатант удаляют, а клетки смешиваются с DMEM достичь концентрации 30 х 10 ⁶ клеток / мл.
3. Теперь клетки смешиваются с 42 ° С теплыми агарозы.
4. Холодный наконечник пипетки может вызвать агарозном закрепить в наконечнике, поэтому он рекомендуется для подогрева наконечник с помощью пипетки горячей стерильной PBS вверх и вниз
5. Теперь же объем агарозы как средства массовой информации занимают и тщательно перемешивают с сотовым медиа-суспензии так, что однородная суспензия будет создан.
6. Держите пробирку Эппендорфа в разогретой водяной бане, помешивая, чтобы агарозном не остыть достаточно, чтобы затвердеть.
7. Когда подвеска однородной, клетки имплантируются в дефект.

Рисунок 1. Корональные Т2 взвешенных изображениях SE (TR 4000 мс / TE 18,27 мс) коленной чашечки образца с имплантированными hMSCs в хрящах дефектов.

Описанные протокол обеспечивает воспроизводимые способ этикетке МСК с наночастицами оксида железа и внедрить эти меченых МСК на дефекты хряща. Эта техника позволяет неинвазивным изображением трансплантации стволовых клеток в дефектов хряща с МРТ, которая позволяет раннего выявления MASI недостаточности. Дислокации или истечение меченых клеток может быть диагностирована на основе исчезновение метки из трансплантации сайта на МРТ. Ранняя диагностика этих событий желательно и не допускал бы пациента от ненужных альтернативных инвазивных диагностических процедур. Описанные неинвазивный метод диагностики MASI результаты могут помочь в успешном развитии клеточной терапии на основе по регенерации хряща при остеоартрите. Наш протокол в настоящее время применяется в доклинических в естественных условиях исследования, было бы в принципе клинически применимый и может служить неинвазивным результат мерой для оценки MASI терапии в клинической практике.