Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

1. Preparazione della griglia di prove di cristallizzazione 2D

1. Carbonio rivestite 400-maglia di rame EM griglie sono preparati da macchia negativa. Acetato di uranile è usato frequentemente e offre una lunga macchia in termini di conservazione della soluzione per diversi mesi prima di utilizzarlo così come idoneità conservazione a lungo termine delle reti. Al contrario, altre macchie negative come formiato di uranile, fornendo colorazione eccellente, devono essere appena fatto ^1. Per la preparazione veloce di un gran numero di griglie da utilizzare per lo screening dei processi di cristallizzazione 2D, una versione modificata di colorazione negativa viene utilizzato. Un volume di 2 ml di campione è pipettato su una griglia di carbonio coperto EM e incubate per 60 s. Questo è seguito da blotting dal bordo con un pezzo strappato di Whatman # 4 carta da filtro (Figura 1; video), e poi 2 ml di acetato di uranile 1% vengono applicate immediatamente, che sono ancora una volta cancellati dal bordo della griglia dopo 30 s. Toccando la griglia sul bordo con il bordo strappato della carta da filtro garantisce la rimozione ottimale di liquido senza rimuovere proteoliposomi. Inoltre, l'essiccazione al bordo della griglia assicura una migliore conservazione del film di carbonio. Si deve prestare attenzione nella preparazione e gestione delle reti, nella rottura del film di carbonio delicato previene l'adesione del campione e può comportare una rappresentazione inesatta del campione. Mentre i volumi campione tradizionalmente più grandi su 5 microlitri erano e sono normalmente utilizzati per la preparazione della griglia, preziosi campioni possono essere salvati, riducendo il volume a 2 microlitri o meno ^2.
2. Per produrre il più grande possibile membrane, alcuni dei nostri campioni richiedono alte concentrazioni di glicerolo o saccarosio (10-20%) di essere presenti nel buffer di dialisi. Questo può avere un effetto negativo sulla preparazione della griglia, come il glicerolo o saccarosio è altamente viscosi e impedisce di acetato di uranile da penetrare correttamente nel buffer, e quindi incompleto colorazione delle membrane. Di conseguenza, un reticolo possibile sarà oscurato. In entrambi i casi il buffer può essere scambiato per centrifugazione dei campioni e sostituzione con glicerolo / saccarosio senza buffer (non mostrato), o le griglie possono essere lavati con tampone o glicerolo / saccarosio senza buffer in una sola per diversi cicli prima di colorazione negativa simile a una tecnica usata per la Cryo-EM ^3,4.

2. Valutare Prove di cristallizzazione 2D di EM

1. A seconda del tipo di supporto del campione, o uno o più griglie vengono caricati. Un ingrandimento di 2-10K, che sarà denominato qui come ingrandimenti intermedi, consente una prima impressione di distribuzione media e l'estensione della dispersione delle membrane, la morfologia e le dimensioni, che è preso atto nel notebook laboratorio ^5. Aree idonee vengono registrati come una panoramica rappresentativa, con l'aiuto di una telecamera CCD o, se una camera CCD non è disponibile, su pellicola.
2. Basso ingrandimento nel range di circa 400-800x è utilizzato nei momenti in cui una panoramica di tutto il campione / griglia è voluta. Pur non essendo impiegato con ogni griglia, basso ingrandimento fornisce preziose informazioni di aiuto nella valutazione della preparazione della griglia, in termini di diversi aspetti: sia le macchie negativo e il potenziale rottura parziale del film di carbonio, la concentrazione del campione sulla griglia di partenza, e forse non uniforme distribuzione proteoliposome. Quadrati della griglia individuo potrebbe essere visto con il binocolo o macchina fotografica CCD. Con un po 'EM è possibile salvare posizioni di particolare interesse, che possono essere richiamati per un controllo in seguito a più alto ingrandimento.
3. Una volta che una zona della griglia di interesse è stato identificato sia a basso ingrandimento o intermedi, l'ingrandimento è cambiato a circa 50K-60K. A seconda membrana, cristallo e cellule dimensioni dell'unità, se noto, ingrandimenti più bassi 30K e 80K alto come vengono utilizzati. La gamma di ingrandimento di 30-80K sarà indicato come alto ingrandimento a scopo di screening per cristalli 2D. Messa a fuoco avviene sia nella messa a fuoco delle basse dosi di set-up, con conseguente passaggio di immagine / foto impostazione, o in prossimità dell'area di interesse.
   1. In caso di ambiguità se l'area di interesse è infatti una membrana, il campione è controllato per il carbonio-film nelle dimensioni dei proteoliposomi, mica, o altri artefatti. A tal fine, bordi rivelano pieghevole e morfologia tipiche.
   2. Ora l'area di interesse viene ispezionato con una telecamera CCD. Una immagine CCD viene raccolto a 30K-80K ingrandimento, a seconda delle dimensioni della membrana, di proteine ​​o di cellule dimensioni dell'unità, o conosciuta zona cristallina. Il reticolo di una proteina di membrana più piccolo e / o per lo più idrofobiche non è necessariamente visibile dalla valutazione visiva delle immagini CCD stesso. Sia l'intera immagine viene utilizzata per un gioco-trasformata di Fourier (FT, o fast FT-FFT). Questo FT conterrà una notevole quantità di rumore, tuttavia, se l'array ordinato è piccolo. Così, un formato ridotto immagine scatola consentirà una migliore rapporto segnale-rumore di un smaller cristallo e più facile identificazione. A tal fine, la casella viene spostato sopra l'immagine e un FT dal vivo è valutata.
      
      L'intensità / luminosità del fascio viene regolata tenendo basse dosi di condizioni per il campione, così come le impostazioni della fotocamera CCD in mente. A seconda della camera CCD utilizzato, la gamma del FT dal vivo è regolata per l'identificazione ottimale degli array ordinato. Un valore troppo alto può oscurare punti grazie ai contributi del rumore, e un valore troppo basso di gamma impedirà più deboli macchie di essere identificati. Questi punti deboli potrebbe essere dovuto alla minore array cristallino con macchie sul Financial Times appena al di sopra del livello di rumore.
      
      Mentre i dati a più alta risoluzione sono stati raccolti su un piccolo numero di campioni ^6, comunemente la risoluzione dei cristalli 2D negativamente macchiato è limitata o non devono essere obbligati ad essere migliore di risoluzione di circa 15 bis. Con un defocus di circa -400 nm, non più di 1-3 ordini di spot dovrebbero essere facilmente identificabili. I campioni non sono generalmente valutati per la risoluzione, come Cryo-EM raccolta dati darà un'indicazione corretta della massima risoluzione ottenibile. Nitidezza di spot e mosaicity possibili sono noti però.
4. Membrane differenti, così come morfologie membrana, vengono valutati per ordine ad alto ingrandimento. Questo è particolarmente critico all'inizio o fasi intermedie di processi di cristallizzazione in 2D, come proteoliposomi più piccoli e non grandi o patch di membrana può contenere le aree più promettenti. Percentuali molto basse di cristalli 2D richiederà l'acquisizione di immagini e FT, o diffrazione ottica, di un gran numero di immagini in quanto l'identificazione iniziale di array ordinati frequentemente portare a rapido miglioramento delle dimensioni e qualità ^2,4,7.

3. Rappresentante Risultati

Proteoliposomi idealmente ordinato visualizzare facilmente riconoscibile, macchie nitide. Cristalli grandi e ben ordinata sono facilmente identificabili dal online-FT di immagini CCD o diffrazione ottica del microscopio.

L'esempio mostra cristalli 2D di una proteina di membrana piccolo di 18kDa che sono fino ad alcuni micron di dimensione. Macchie sul FT sono facilmente identificabili e taglienti. Il movimento del live-FT box mostra che il reticolo è continuo senza mosaicity. Il reticolo di una proteina più grande, con un dominio più esteso solubili possono essere identificati sul piccolo schermo della EM. Raccolta di immagini CCD e FT è necessario per fornire un mezzo di una migliore valutazione e per ottenere informazioni su, ad esempio, mosaicity possibile (mostra FT). Quando calcolo di una FT di un proteoliposome che non viene imposta, il rumore può essere inizialmente scambiato per spot. Mentre la casella per il live-FT è spostato, però, gli spot spariranno. D'altra parte, piccoli array, con cristallinità discutibile, avranno i loro angoli ancora ferma quando il live-FT si muove anche di poco sopra la zona dell'immagine. Inoltre, questi piccoli cristalli possono essere riconosciute dal solito hanno le stesse dimensioni delle celle unità, e le distanze tra i punti in FTS può essere misurato in vari modi, ad esempio con un cerchio di una dimensione specifica. Cristalli di lipidi mostra una morfologia distinta reticolo e FT.

Non è raro incontrare precipitazioni nelle prove iniziali. Qui la precipitazione delle proteine ​​senza ricostituzione deve essere distinto da aggregati lipidici piccola. I campioni che sembrano essere precipitati a basso ingrandimento spesso si rivelano essere aggregati lipidici se visto a più alto ingrandimento. A fronte di ispezione a 30-50K, i bordi di queste strutture scuro rivela loro di essere composto da membrane senza precipitazione delle proteine. Queste osservazioni sono importanti quanto gli aggregati lipidici potrebbe essere aumentata per dimensioni a membrane grandi i seguenti esperimenti.

Scarsi risultati in campioni di valutazione sono talvolta collegati ad una bassa concentrazione di membrana che impedisce un adeguato screening e veloce. Questo può spesso essere superato con l'uso di una concentrazione di proteine ​​per la cristallizzazione 2D con la dialisi. In alternativa, le membrane può essere lasciata riposare per alcuni giorni sul fondo della provetta Eppendorf durante la conservazione. In alcuni casi un rapido assestamento, o quasi istantanea delle membrane si verifica e pipettaggio dal fondo del tubo si tradurrà in una maggiore densità di membrana sulla griglia. Un'altra opzione è molto più veloce centrifugazione (a 3000-8000 giri per 1-3 minuti) di campioni con successivi prelievi dal fondo del tubo.

I campioni in condizioni ottimali conterrà una grande percentuale di cristalli 2D. Non è necessario puntare per un aspetto omogeneo delle membrane, come la raccolta più grande e cristalli ben ordinata 2D sono selezionati visivamente per i dati. Questi tipi di campioni sarà facilmente riconosciuta quando le prove di cristallizzazione si ripetono così come quando i campioni sono utilizzati perCryo-EM raccolta di dati, per un numero massimo di immagini ad alta risoluzione.

Figura 1. La figura mostra assorbente il bordo della griglia con un pezzo strappato di Whatman # 4 carta da filtro.

Corretta valutazione dei campioni esige un'attenta valutazione di un numero sufficiente di membrane. Per esempio, i campioni con più basso del 2% array cristallino di oltre 180 proteoliposomi ripreso ha dato delle informazioni critiche per l'ottimizzazione rapida delle condizioni di cristallizzazione 2D ^7.

Quando precipitazione delle proteine ​​si verifica, una griglia potrebbe essere abbandonata dallo screening ulteriormente dopo l'ispezione a basso ingrandimento, anche se occasionali precipitazioni parziale di proteine ​​si verifica. Anche le membrane molto piccolo di meno di 100 nm può dare informazioni utili su ordine però, e parametri per aumentare la dimensione 2D cristallo può essere implementato in seguito agli esperimenti di dialisi.

I laboratori sono in fase di introduzione di diversi gradi di automazione promettente nel processo di screening ^8,9. Eppure, campioni saranno ancora bisogno di punti di valutazione e conoscenza delle dimensioni dei cristalli 2D, morfologia, e l'ordine come indicato qui. In futuro, potrebbe diventare possibile analizzare i dati di sempre più piccoli cristalli 2D a una risoluzione più alta, rendendo queste operazioni di screening e la valutazione più difficile di aree più piccole cristallino ancora più critica.