分离和富集大鼠间质干细胞（MSCS）及衍生的干细胞分离单细胞集落

1。大鼠MSCs的分离

从6-8周龄只Sprague - Dawley雌性大鼠如前所述^1，2间质干细胞分离。隔离的MSCs能坚持到塑料表面，并轻松地扩展在体外培养。

1. 动物被放入一个麻醉室，麻醉，大约5分钟。在麻醉，观察闪烁，呼吸和运动活动的速度。立即从腔中取出的动物后，停止电机活动，成为罕见的闪烁速率。
2. 打下的动物，一个操作站上颈椎脱位并杀死动物。切断从后面肢体的股骨和胫骨，去除皮肤和肌肉。
3. 70％异丙醇几秒钟解剖股骨和胫骨，并转移到1X的D - PBS。
4. 在生物安全柜，股骨和胫骨被转移到一个10厘米菜的DMEM。每个骨骼，然后用镊子举行，并用剪刀打开两端被切断。将一个22G的针头到3毫升注射器和填充用DMEM，然后冲入一个50毫升管插入一个开口端的骨针的骨髓。重复2〜3倍，每块骨骼。当所有的骨髓获得，悬浮细胞，并通过一个70μm细胞过滤器的细胞悬液，以去除骨碎片和血液总量。
5. 离心200克细胞，4℃5分钟，取出吸上清液。于25ml MSC介质的悬浮细胞（DMEM含10％胎牛血清和1％的笔链球菌）。 10ml细胞悬浮液中接种到每一个10cm的培养皿中，共两道菜。 1〜2周保持在37℃和5％的CO ₂培养箱培养皿。换液，每隔2〜3天。

2。富集大鼠MSCs

已被用于一些表面蛋白，以丰富的干细胞，包括CD54，CD90，CD73，CD105和^CD271 3-5 。在我们的研究中，我们作为标记CD54和CD90，以丰富磁性细胞分选干细胞。

1. 当细胞达到80％左右汇合，吸出培养基，添加4〜5毫升胰蛋白酶EDTA每一道菜。把菜肴的孵化器和孵化约5分钟，以使细胞脱落。一旦细胞分离，加等量的培养基灭活胰蛋白酶。收集到一个15毫升管和自旋细胞，细胞悬液200克，4℃5分钟。
2. 接下来的步骤描述如何充实两个表面标志物CD54和CD90干细胞，根据细胞分离使用屋宇署IMagnet手册。悬浮细胞沉淀在细胞染色缓冲液（3％热灭活FBS 1X的D - PBS）为20万细胞/ ml。添加生物素标记的CD54抗体（0.25μg每百万个细胞）和生物素标记的CD90抗体（0.15μg每百万个细胞），轻轻混合细胞悬液。冰15分钟的潜伏期后，标记的细胞被洗净，用1X BD IMAG缓冲区的过剩量。标记的细胞被降速200克，4℃5分钟。
3. 涡屋宇署IMAG链霉亲和素粒子彻底，加40μl颗粒每10万个单元格。彻底标记细胞混合粒子和细胞孵育6〜12℃30分钟。这允许绑定到链霉亲和颗粒的生物素标记的抗CD54和抗CD90，这是必然的表面蛋白CD54和CD90分别。
4. 在孵化时，标签的圆底试管收集的积极的一小部分。孵化后，将标签卷20万个细胞/毫升1X屋宇署IMAG缓冲区和标记细胞转移到积极的馏分收集管。放置到BD IMagnet的积极的一小部分管，并让它停留6分钟，然后取出上清液用玻璃巴斯德吸管的积极的一小部分管的BD IMagnet仍然。
5. 屋宇署IMagnet的积极的一小部分管取出，并置于冰上。添加1毫升冰冷1X屋宇署IMAG缓冲区，并轻轻搅拌悬浮细胞。管放置到BD IMagnet并让它留2〜4分钟。取出上清液用一个新的玻璃巴斯德吸管。重复洗涤2.5之一更多的时间。
6. 删除屋宇署IMagnet和悬浮细胞培养液中，种子之一75厘米²瓶维持细胞和流式细胞仪10厘米菜管。

3。流式细胞仪检测表面标志表达的验证

流式细胞仪分析，以验证我们得到的细胞表达CD54和CD90。 HSC的标记CD45的被用来证实，干细胞造血干细胞耗尽。

1. 当细胞成为〜80％汇合，trypsinize用胰蛋白酶- EDTA的细胞，并收集到一个15毫升管细胞。在200克，4 ° C下5分钟离心收集细胞。
2. 吸弃上清液，并H细胞与1X的D - PBS一次。悬浮细胞在细胞染色缓冲液（1X的D - PBS含2％FBS和0.05％叠氮钠）的终浓度为5〜10万细胞/毫升，并保持在冰上的细胞。 （; 2亚型控制IgG2a;。3同型对照IgG1的; CD45; 5 CD54的; 6 CD90细胞只）分装100微升到6个标记的试管中的细胞悬液。
3. 添加适当浓度的同型对照和初级抗体（IgG2a和IgG1：20μL，每百万个细胞; CD45：0.5μg每百万个细胞; CD54：0.25μg每百万个细胞; CD90：0.15μg每百万个细胞），并在4 ° C孵育30分钟。
4. 1X的D - PBS洗涤细胞两次，然后悬浮细胞100μL细胞染色缓冲。新增的SA - PE（藻红蛋白链霉菌，使用每百万个细胞0.15μg）和孵育4℃30分钟，在黑暗的彗星。
5. 1X的D - PBS清洗两次标记的细胞。在400μl细胞染色缓冲液重悬细胞，流式细胞仪分析和转让猎鹰管。

4。衍生的干细胞分离单细胞集落

干细胞是一种异质性的人口与不同的细胞形态，生长速度以及^分化能力6的不同亚群组成。然而，所有的亚群表达称为MSC的标记，因此它是不可行的使用标记分离出这些亚群。因此，我们应用克隆气瓶分离出不同的亚群，这是由单细胞组成的殖民地。

1. 在大约50〜100个细胞10厘米菜板细胞。在37℃和5％CO ₂培养箱中孵育1〜2周。在此期间，研究倒置显微镜以及孤立的殖民地。一旦殖民地已经达到了足够大的尺寸（更好的超过100个细胞在每一个殖民地），马克在盘底部sharpie的殖民地。当挑选标明的殖民地，确保附近捡到一个有没有周围的殖民地。
2. 吸中期和1X的D - PBS洗一次菜。拿起无菌克隆气缸，用无菌镊子轻轻周围放置标记的殖民地。重复此标记的殖民地，直到所有克隆缸放置在。挑选菌落应远离对方，每一个克隆缸只包含一个殖民地。
3. 加入100μL胰蛋白酶EDTA每个克隆缸，并把这道菜〜5分钟的孵化器。 5分钟后，细胞在显微镜下检查，看看他们是否四舍五入。当细胞有向上抬起，加等量的培养基灭活胰蛋白酶。用200μL移液器混合细胞悬液，细胞悬液转移到60毫米菜含有3毫升预热培养基。标签正确的菜，放入孵化器。在未来数天的跟踪形态变化。

5。代表性的成果

据塑料贴壁细胞在大鼠MSCs隔离的一部分描述的协议，应该是可见的镀后的第二天。当细胞继续增殖，看起来应该像图1A所示的细胞融合细胞。当细胞到达〜80％汇合（图1B），传代，可以进行。在继代培养，胰蛋白酶EDTA用于分离细胞和解除细胞小而圆图1C所示。

图1。大鼠MSCs的相衬图像。 （一）聚合MSCS。多数细胞的纺锤状或明星般的。 （二）干细胞在80％左右汇合。 （三）解除后胰蛋白酶的细胞小而圆。

一旦干细胞富集磁性细胞分选，流式细胞仪分析，以验证表面标志表达。如果浓缩是好的，细胞显示对HSC的标记CD45（图2）对MSC的标志物CD54和CD90阳性染色阴性。同型对照IgG2a和IgG1被用来作为阴性对照。

图2。流干细胞表面标志的流式细胞仪分析 。MSCs的标记与IgG2a，IgG1的（2亚型控制）（同型对照1），CD45，CD54和CD90抗体。干细胞表达CD54和CD90，但不CD45的。

当种子细胞在适当的克隆密度，菌落上升，从单细胞。图3A代表一个单细胞形成一个殖民地。克隆气瓶然后可以用来单独来自殖民地的殖民地和细胞可单独培养。图3B和3C代表从两个独立的殖民地衍生细胞。从殖民地1派生的细胞主轴像（图3B），而从殖民地2所产生的细胞是圆形（图3C）。

本协议描述了如何隔离和丰富的MSCs。一个分开的单细胞集落来源的细胞的方法也纳入其中。有几个步骤，是一个成功的分离，浓缩和殖民地分离的重要。虽然从大鼠细胞分离，这是建议通过细胞过滤器或类似大小的无菌尼龙网，清除血块和骨碎片的过滤器。电镀后的细胞在一夜之间，许多死细胞，将浮在中期和去除死细胞更换新鲜培养基，这应有助于贴壁细胞的生长。

磁性细胞，在这个协议中的排序描述如何执行积极的选择，并且可以使用类似的程序来执行一个负选择。要添加的抗体量可能会有所不同，需要优化，以达到更好的排序。这也是真正的标记流式细胞仪分析细胞。如果没有运行标记的样品立即流式细胞仪分析，样品可以用2％甲醛固定，并在以后运行。然而，长期储存不建议，因为这会增加自体荧光和牺牲样品质量。

殖民地分离的关键部分是在合适的细胞密度播种（这应该是优化实验）和定位不是由其他克隆包围的单一克隆。如果附近有其他克隆，克隆缸可能包括附近的克隆，获得的细胞将不再从一个克隆。当放置在克隆的克隆缸，也可以小心滑过盘表面，因为这会导致克隆缸底部硅脂覆盖细胞和深远的细胞分离，防止胰蛋白酶。