Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs

1. Isolamento de CTMs Rat

Células-tronco mesenquimais foram isoladas 6-8 semanas de ratos Sprague-Dawley, sexo feminino, como descrito anteriormente ^{1, 2.} MSCs isoladas podem aderir à superfície de plástico e facilmente expandir durante a cultura in vitro.

1. O animal foi colocado em uma câmara de anestesia e anestesiados por cerca de cinco minutos. Durante a anestesia, observe a taxa de respiração, piscando e atividade motora. Remover o animal da câmara, imediatamente após parar a atividade motora ea taxa de piscar se tornou freqüente.
2. Lay o animal para baixo em uma estação de operação e matar o animal por deslocamento cervical. Cortar o fémur ea tíbia de membros de volta, retire a pele e os músculos.
3. Coloque os fêmures dissecados ea tíbia em 70% isopropanol por alguns segundos e transferência para 1X D-PBS.
4. Em um armário de biossegurança, o fémur ea tíbia foram transferidos para um prato de 10 centímetros contendo DMEM. Cada osso foi então realizada com pinças e as duas extremidades foram cortadas aberto com uma tesoura. Coloque uma agulha 22G a uma seringa de 3 ml e preenchê-lo com DMEM e então dê descarga da medula em um tubo de 50ml, inserindo a agulha de uma extremidade aberta do osso. Repetir 2 a 3 vezes para cada osso. Quando todas as abóboras foram obtidos, ressuspender as células e passar a suspensão de células através de um filtro de células 70μm para remover os escombros dos ossos e agregados sangue.
5. Spin down células em 200g, 4 ° C por 5 minutos e retire o sobrenadante por aspiração. Ressuspender as células em 25ml médio MSC (DMEM contendo 10% FBS e 1% Pen-Strep). 10ml de suspensão celular foi semeado em cada placa de cultura 10 centímetros para um total de dois pratos. Manter os pratos da cultura em 37 ° C e 5% incubadora de CO ₂ para 1 a 2 semanas. Meio foi trocado a cada 2 a 3 dias.

2. Enriquecimento de Rat MSCs

Uma série de proteínas de superfície foram utilizados para enriquecer MSCs, incluindo CD54, CD90, CD73, CD105 e CD271 ^3-5. Em nosso estudo, usamos CD54 e CD90 como marcadores para enriquecer MSCs por separação de células magnéticas.

1. Quando as células atingiram cerca de 80% confluência, aspirar o médio e adicione 4 ~ 5 ml de tripsina-EDTA para cada prato. Coloque os pratos de volta para a incubadora e incubar por cerca de 5 minutos para permitir que o desapego celular. Uma vez que as células foram destacadas, adicionar igual quantidade de meio de cultura para inativar a tripsina. Coletar suspensão de células em um tubo de 15ml e células spin down em 200g, 4 ° C por 5 minutos.
2. Os próximos passos descrevem como enriquecer MSCs por dois marcadores de superfície CD54 e CD90 de acordo com o manual para separação de células usando BD IMagnet. Pellet celular foi ressuspenso em tampão de coloração de células (3% de calor FBS inativada em 1X D-PBS) a 20 milhões de células / ml. Anticorpos CD54 biotinilado (0.25μg por milhão de células) e de anticorpos CD90 biotinilado (0.15μg por milhão de células) foi adicionado e misturado levemente com a suspensão de células. Após a incubação em gelo por 15 minutos, células marcadas foram lavados com um volume acima de 1X tampão Imag BD. As células marcadas foram girados para baixo em 200g, 4 ° C por 5 minutos.
3. Vortex da BD partículas Imag estreptavidina bem, junta-partículas 40μl para cada 10 milhões de células. Mix da partícula com as células marcadas bem e incubar as células em 6 ~ 12 ° C por 30 minutos. Isto permite que as partículas de estreptavidina para vincular ao biotinilado anti-CD54 e anti-CD90, que é ligado às proteínas de superfície CD54 e CD90, respectivamente.
4. Durante o tempo de incubação, rotular um tubo de ensaio de fundo redondo para coletar a fração positiva. Após a incubação, reduzir o volume de rotulagem para 20 milhões de células / ml com tampão 1X Imag BD e transferência de células marcadas para o tubo de coleta fração positiva. Coloque o tubo a fração positiva para o IMagnet BD e deixe ficar durante 6 minutos, em seguida, remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur de vidro com tubo a fração positiva ainda na IMagnet BD.
5. Retire o tubo fração positiva do IMagnet BD e colocá-lo no gelo. Adicionar 1 ml gelada 1X tampão BD Imag e células ressuspender pela mistura suave. Colocar o tubo de volta para o IMagnet BD e deixá-lo ficar para 2 a 4 minutos. Remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur de vidro novo. Repita a lavagem como descrito em 2.5 mais uma vez.
6. Remova o tubo do IMagnet BD e células ressuspender em meio de cultura, uma semente 75 centímetros ² recipiente para manter as células e um prato de 10 centímetros de citometria de fluxo.

3. Verificação de Expressão marcador de superfície por citometria de fluxo

Citometria de fluxo foi realizada para verificar as células obtivemos expressar CD54 e CD90. O HSC marcador CD45 foi usada para confirmar que as CTMs foram esgotados de HSCs.

1. Quando as células se tornam confluentes ~ 80%, trypsinize células com tripsina-EDTA e recolher as células em um tubo de 15ml. Centrifugar a 200 g, 4 ° C por 5 minutos para coletar as células.
2. Aspirar o sobrenadante e foih com células 1X D-PBS uma vez. Ressuspender as células em tampão de coloração celular (1X D-PBS contendo 2% de SFB e azida sódica 0,05%) para uma concentração final de 5 ~ 10 milhões de células / ml e manter as células no gelo. Alíquota de 100μl suspensão de células em seis tubos rotulados (1 apenas as células; 2. Isotipo IgG2a controle;.. 3 para controlo do isotipo IgG1, 4 CD45; 5. CD54;.. 6 CD90).
3. Adicionar controles isotipo e anticorpos primários em concentrações apropriadas (IgG2a e IgG1: 20μl por milhão de células, CD45: 0.5μg por milhão de células, CD54: 0.25μg por milhão de células, CD90: 0.15μg por milhão de células) e incubar a 4 ° C para 30 minutos.
4. Lavar as células com 1X D-PBS duas vezes e, em seguida, as células ressuspender em tampão 100μl de células coloração. Adicionar SA-PE (estreptavidina-ficoeritrina, use 0.15μg por milhão de células) e incubar a 4 ° C por 30 minutos no escuro.
5. Lave as células marcadas com 1X D-PBS duas vezes. Ressuspender as células em tampão 400μl de células de coloração e transferir para um tubo falcon para análise de citometria de fluxo.

4. Separação da colônia Único Derivado MSCs

MSCs é uma população heterogênea composta por diferentes subpopulações de células com formato diferente, a taxa de crescimento, bem como capacidade de diferenciação ^6. No entanto, todas as sub-populações de expressar os marcadores MSC conhecida e, portanto, não é viável a utilização de marcadores para separar estas subpopulações. Por isso, aplicou-se cilindros de clonagem para separar os diferentes subpopulações, que são colônias formadas por células individuais.

1. Células placa em cerca de 50 ~ 100 células por prato de 10cm. Incubar a 37 ° C e 5% incubadora de CO ₂ para 1 a 2 semanas. Durante este período, examine colônias bem isoladas com um microscópio invertido. Uma vez que as colônias tenham atingido o tamanho suficientemente grande (melhor mais de 100 células em cada colônia), marca as colônias com uma sharpie no fundo do prato. Quando escolher a colônia a ser marcado, certifique-se que não há colônias vizinhas perto o escolhido.
2. Aspirar médio e lave o prato uma vez com 1X D-PBS. Pegue um cilindro clonagem estéril com uma pinça estéril e delicadamente colocá-lo em torno da colônia marcada. Repita este procedimento até todas as colônias marcado tem um cilindro colocado sobre clonagem. As colônias escolhidas devem ser longe uns dos outros, tais que cada cilindro clonagem contém apenas uma colônia.
3. Adicionar 100μl de tripsina-EDTA para cada cilindro de clonagem e colocar o prato de volta para a incubadora de ~ 5 minutos. Após 5 minutos, verifique as células ao microscópio para ver se eles estão de arredondamento para cima. Quando as células têm levantado, adicionar igual quantidade de meio de cultura para inativar a tripsina. Misture a suspensão celular com uma micropipeta 200μl e transferir a suspensão celular a um prato 60 milímetros contendo 3ml meio de cultura pré-aquecido. Rotular os pratos corretamente e colocá-los de volta para a incubadora. Controle de alterações morfológicas sobre os próximos dias.

5. Resultados representante

De acordo com o protocolo descrito na parte de rato isolamento MSCs, plástico MSCs aderente deve ser visível no dia seguinte após o plaqueamento. Como as células continuam a proliferar as células confluentes deve se parecer com as células mostrado na Figura 1A. Quando as células atingem a 80% confluência (Figura 1B), subcultura pode ser realizada. Durante a subcultura, tripsina-EDTA foi usado para separar as células e células levantou são pequenos e redondos, como mostrado na Figura 1C.

Figura 1. Imagens de contraste de fase de rato MSCs. (A) Confluent MSCs. A maioria das células são fusiformes ou estrela-like. (B) MSCs cerca de 80% confluência. (C) células Lifted após tripsinização são pequenas e redondas.

Uma vez que as CTMs são enriquecidos por separação de células magnética, análise de citometria de fluxo é realizada para verificar as expressões marcador de superfície. Se o enriquecimento é bom, as células devem mostrar coloração positiva contra os marcadores CD54 e CD90 MSC, mas negativa contra o marcador CD45 HSC (Figura 2). Isotipo IgG2a e IgG1 controles são utilizados como controles negativos.

Figura 2. Análise de citometria de fluxo de MSCs de marcadores de superfície. MSCs foram marcadas com anticorpos contra IgG2a (isotipo controle 1), IgG1 (isotipo controle 2), CD45, CD54 e CD90. MSCs expressa CD54 e CD90, mas não CD45.

Quando as células são semeadas em densidade adequada clonal, as colônias devem subir a partir de células individuais. Figura 3A representa uma colônia formada por uma única célula. Cilindros de clonagem pode ser usado para separar as colônias e células derivadas das colônias podem ser cultivadas separadamente. Figura 3B e 3C representa células derivadas de duas colônias individual. A colônia de células derivadas de um eixo como são (Figura 3B), enquanto que as células derivadas de colônia dois são redondos (Figura 3C).

Este protocolo descreve como isolar e enriquecer MSCs. Um método para separar as células-colônia única derivada é também incorporada. Há várias etapas que são importantes para uma separação de enriquecimento, isolamento e colônia de sucesso. Ao fazer o isolamento de células de rato, recomenda-se filtro através de um filtro de célula ou uma malha de nylon estéril de tamanho similar para se livrar dos coágulos de sangue e restos de ossos. Após o plaqueamento das células durante a noite, muitas células mortas estará flutuando no meio e as células mortas são removidas, substituindo com meio fresco que deve ajudar o crescimento das células em anexo.

A célula magnética classificação neste protocolo descreve como realizar uma seleção positiva, e procedimentos similares podem ser usados ​​para executar uma seleção negativa. A quantidade de anticorpos para ser adicionado podem diferir e otimização é necessária para conseguir uma melhor classificação. Isto também é verdade para a rotulagem das células para a análise de citometria de fluxo. Caso não esteja executando análise de citometria de fluxo para as amostras rotuladas imediatamente, as amostras podem ser fixados com formaldeído 2% e executado mais tarde. No entanto, armazenamento de longo prazo não é recomendado uma vez que este tende a aumentar a auto-fluorescência e qualidade da amostra sacrifício.

A parte fundamental para a separação colônia é semeadura na densidade das células direita (que deve ser otimizado experimentalmente) e localização de clones único que não são cercados por outros clones. Se houver outros clones nas proximidades, o cilindro de clonagem pode englobar os clones nas proximidades e as células obtidas deixará de ser de um clone. Ao colocar o cilindro sobre a clonagem clone, também tenha cuidado para não deslize-o sobre a superfície do prato, pois isso fará com que a graxa de silicone na parte inferior do cilindro de clonagem para cobrir as células e impedir a tripsina de alcançar as células para destacá-las.