İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma

1. Rat MKH izolasyonu

Önceden ^1'de açıklandığı gibi, 6-8 hafta eski Sprague-Dawley erkek ^{sıçan, 2} mezenkimal kök hücreleri izole edildi. İzole MKH plastik yüzeyine yapışır ve in vitro kültür sırasında kolayca genişletebilirsiniz.

1. Hayvan anestezi odasına koyun ve yaklaşık beş dakika boyunca anestezi oldu. Anestezi sırasında, yanıp sönen, solunum ve motor aktivite oranı gözlemliyoruz. Motor aktivite durur ve yanıp sönen oranı seyrek olduktan sonra hemen odasından hayvan çıkarın.
2. Bir operasyon istasyonunda hayvan uzanın ve servikal dislokasyon hayvan öldürmek. Arka bacaklarda femur ve tibiaları kesilmiş, cilt ve kasların çıkarın.
3. Birkaç saniye için% 70 izopropanol disseke femur ve tibiaları koyun ve 1X D-PBS transfer.
4. Biyogüvenlik kabini, femur ve tibiaları DMEM içeren bir 10cm çanak transfer edildi. Her kemik, sonra cımbız ile yapıldı ve iki ucu açık bir makas kesilmiştir. 3ml bir enjektöre 22G iğne takın ve DMEM ile doldurun, sonra kemik bir açık ucuna iğne takarak 50ml tüp içine iliği yıkayın. 2 ~ 3 kez her kemik için bu işlemi tekrarlayın. Ilikleri elde edildiğinde, hücreler tekrar süspansiyon ve kemik artıkları ve kan agrega kaldırmak için hücre süspansiyonu 70μm hücre süzgecinden geçirmek.
5. 200 gr az hücreleri, 4 ° C 5 dakika aşağı Spin ve aspirasyon ile süpernatantı kaldırmak. 25ml MSC ortamda yeniden süspanse hücreleri (% 10 FBS ve% 1 Kalem-Strep içeren DMEM). 10ml hücre süspansiyonu, toplam iki çanak için her 10cm kültür çanak numaralı seribaşı oldu. 1 ~ 2 hafta boyunca 37 ° C _ve% 5 CO2 inkübatör kültür kaplarında saklayın. Orta 2 ~ 3 günde bir değiştirildi.

2. Rat MKH zenginleştirilmesi

CD54, CD90, CD73, CD105 ve CD271 ^3-5 da dahil olmak üzere, MKH zenginleştirmek için bir dizi yüzey proteinleri kullanılmıştır. Bu çalışmada, manyetik hücre sıralayarak MKH zenginleştirmek için işaretleyici olarak kullanılan CD54 ve CD90.

1. Hücreleri confluency 80% ulaştığında, orta aspirat ve her yemek için 4 ~ 5ml tripsin-EDTA ekleyin. Bulaşıkları inkübatör geri koyun ve hücre dekolmanı izin için yaklaşık 5 dakika boyunca inkübe. Hücreleri, müstakil kültür ortamı eşit miktarda tripsin inaktive edildi. 4 ° C, 5 dakika boyunca 200 gr 15ml tüp ve spin hücreleri hücre süspansiyonu toplayın.
2. Sonraki adımlar BD IMagnet kullanarak hücre ayrılması için kılavuzuna göre iki yüzey belirteçleri CD54 ve CD90 ile MKH zenginleştirmek için nasıl açıklar. Hücre pelet, 20 milyon hücre / ml hücre boyama tamponu (1X D-PBS içinde% 3 ısı inaktive FBS) yeniden süspanse edildi. Biotinlenmiş CD54 antikor (milyon başına 0.25μg hücreleri) ve biotinlenmiş CD90 antikor (milyon hücre başına 0.15μg) eklenir ve hücre süspansiyonu ile hafifçe karıştırılır. 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübasyondan sonra, işaretli hücrelerin aşırı 1X BD IMAG tampon hacmi ile yıkandı. Etiketli hücreler 5 dakika boyunca, 4 ° C 200g aşağı bükülmüş.
3. Vortex BD IMAG streptavidin parçacıkları iyice, her 10 milyon hücre 40μl parçacıkları ekleyin. Parçacık etiketli hücreleri ile iyice karıştırın ve hücrelerin ~ 12 ° C'de 30 dakika süreyle 6 inkübe. Bu streptavidin parçacıklar bağlamak için sırasıyla CD54 ve CD90 yüzey proteinlerine bağlı olduğu, biotinlenmiş anti-CD54 ve anti-CD90.
4. Inkübasyon süresi boyunca, olumlu bir kısmını toplamak için yuvarlak bir alt test tüpü etiket. Inkübasyondan sonra, 20 milyon hücre / ml 1X BD IMAG tampon ile etiketleme ses getirmek ve etiketli hücreleri pozitif fraksiyon toplanması tüp transferi. BD IMagnet üzerine yerleştirin ve pozitif fraksiyonu tüp kalmasına izin, 6 dakika sonra BD IMagnet hala olumlu bir fraksiyonu tüp ile bir bardak Pasteur pipeti ile süpernatant kaldırmak.
5. BD IMagnet pozitif fraksiyonu tüp çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. 1ml buz 1X BD IMAG tampon ve nazik karıştırılarak tekrar süspansiyon hücreleri ekleyin. Tüp BD IMagnet üzerine yerleştirin ve 2 ~ 4 dakika kalmasına izin. Yeni bir cam Pasteur pipeti ile süpernatantı. 2.5 bir kez daha açıklandığı gibi yıkama işlemi tekrarlayın.
6. BD IMagnet ve kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri, tohum hücreleri ve flow sitometri için 10cm çanak korumak için 75cm ² balon tüp çıkarın.

3. Yüzey Marker İfade Sitometrisi ile doğrulanması

Flow sitometri analizi ifade CD54 ve CD90 elde edilen hücreler doğrulamak için yapıldı. HSC işaretleyici CD45 MKH HKH'lerin mahrum olduklarını teyit etmek için kullanılmıştır.

1. Hücreleri ~% 80 konfluent hale geldiğinde, tripsin-EDTA ile hücreleri trypsinize ve 15ml bir tüp içine hücreleri toplamak. 200g, 4 ° C 5 dakika hücreleri toplamak için santrifüjleyin.
2. Süpernatant aspire.h kez 1X D-PBS ile hücreler. Son bir konsantrasyon 5 ~ 10 milyon hücre / ml ve buz üzerinde hücrelerin tutmak hücre boyama tampon yeniden süspanse hücreleri (1X D-PBS% 2 ve% 0.05 sodyum azid FBS içeren). (2 izotip kontrolü IgG2a;.. 3 İzotip kontrolü IgG1, 4 CD45; 5 CD54;.. 6 CD90 1 hücreleri sadece) altı etiketli tüpler içine kısım 100μl hücre süspansiyonu.
3. (:: 0.5μg milyon başına hücreleri; CD54: 0.25μg milyon başına hücreleri; CD90: CD45 hücreleri 20μl milyon başına IgG2a ve IgG1 0.15μg milyon başına hücreleri) uygun konsantrasyonları izotip kontrol ve primer antikor ekleyin ve 4 ° C'de inkübe 30 dakika.
4. 100μl hücre boyama tampon 1X D-PBS ile iki kez ve daha sonra tekrar süspansiyon hücreleri hücrelerinin yıkayın. SA-PE (streptavidin fikoeritrin milyon hücre başına 0.15μg kullanın) ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika karanlıkta.
5. Etiketli hücreleri 1X D-PBS ile iki kez yıkayın. 400μl hücre boyama tampon hücrelerin yeniden süspanse edin ve flow sitometri analizi için bir şahin tüp transferi.

4. MKH Türetilmiş Tek koloni ayrılması

MKH farklı hücre şekli, büyüme oranı gibi farklılaşma yeteneğinin ⁶ farklı alt popülasyonlar oluşan heterojen bir nüfus. Ancak, tüm alt popülasyonlar bilinen MSC belirteçlerinin ifade etme ve bu nedenle bu alt popülasyonlar ayrı işaretleri kullanmak mümkün değildir. Bu nedenle, tek hücre oluşturduğu koloni farklı alt popülasyonlar, ayırmak için uygulanan klonlama silindir.

1. ~ 10cm çanak başına yaklaşık 50 100 hücre Plaka hücreleri. 1 ~ 2 hafta boyunca 37 ° C _ve% 5 CO2 inkübatör inkübe edin. Bu dönemde, ters bir mikroskop ile iyi izole koloniler inceleyin. Koloniler yeterince büyük boyut (her koloni 100'den fazla hücre daha iyi) ulaştığında, çanak alt kısmında bir sharpie koloniler işaretleyin. Işaretlenir koloni almak zaman aldı birinin yakınında herhangi bir çevre koloniler olmadığından emin olun.
2. Aspire orta ve çanak 1X D-PBS ile bir kez yıkayın. Steril bir forseps ile steril bir klonlama silindir Pick up ve nazikçe işaretlenmiş koloni çevresinde yer. Işaretli tüm koloniler üzerine yerleştirilen bir klonlama silindir kadar bu işlemi tekrarlayın. Aldı koloniler her klonlama silindir sadece bir koloni içerdiğini birbirlerine uzak olmalıdır.
3. 100μl tripsin-EDTA her klonlama silindir ekleyin ve ~ 5 dakika süreyle geri inkübatör çanak koymak. 5 dakika sonra, onlar kadar yuvarlama olup olmadığını görmek için mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Hücreler yukarı kaldırdı, tripsin inaktive kültür ortamı eşit miktarda ekleyebilirsiniz. 200μl micropipettor hücre süspansiyonu karıştırın ve 60mm çanak 3ml prewarmed kültür ortamı içeren bir hücre süspansiyonu aktarmak. Bulaşıkları düzgün Etiket ve kuvöz içine geri koymak. Önümüzdeki birkaç gün içinde morfolojik değişim izleme.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Sıçan MKH izolasyonu için kısmen açıklanan protokole göre, plastik yapışık MKH kaplama sonraki gün görünür olmalıdır. Hücrelerin sayısı hızla artmaya devam ederken, konfluent hücreleri Şekil 1A gösterilen hücreler gibi görünmelidir. Hücrelerine ula geldiğinde ~ confluency% 80 (Şekil 1B), alt kültüre yürütülen olabilir. Altkültürü sırasında, tripsin-EDTA hücreleri ayırmak için kullanılan ve Şekil 1C gösterildiği gibi kaldırdı hücreleri küçük ve yuvarlak.

Şekil 1. Sıçan MKH Faz kontrastlı görüntüler. (A) konfluent MKH. Hücrelerin büyük çoğunluğu mili gibi ya da yıldız gibi. (B) MKH yaklaşık% 80 confluency. (C) trypsinization sonra kaldırdın hücreleri küçük ve yuvarlak.

Bir kez MKH manyetik hücre sıralama ile zenginleştirilmiş, flow sitometri analizi, yüzey işaretleyici ifadeleri doğrulamak için yapılır. Zenginleştirme iyi ise, hücreler HSC marker CD45 (Şekil 2) karşı olumlu MSC belirteçlerinin CD54 ve CD90 karşı boyama ancak olumsuz göstermek gerekir. İzotip denetimleri IgG2a ve IgG1 negatif kontrol olarak kullanılır.

Şekil 2. Yüzey belirteçleri için MKH Flow sitometri analizi. MKH IgG2a (izotip kontrolü 1), IgG1 (izotip kontrolü 2), CD45, CD54 ve CD90 karşı antikorlar ile etiketlenir. MKH CD54 ve CD90 ifade değil CD45.

Hücreleri uygun klonal yoğunlukta numaralı seribaşı zaman, koloniler tek hücre çıkmalıdır. Şekil 3A, tek bir hücrenin oluşturduğu bir koloni temsil eder. Klonlama silindir sömürgelerden elde edilen koloniler ve hücreler ayrı ayrı kültürü ayrı kullanılabilir. Şekil 3B ve 3C iki ayrı koloniler elde edilen hücreler temsil eder. Koloni 2 türetilen hücreler (Şekil 3C) yuvarlak ise koloni 1 türetilen hücreleri gibi mili (Şekil 3B).

Bu protokol, izole etmek ve zenginleştirmek MKH anlatılmaktadır. Tek koloni elde edilen hücreleri ayırmak için bir yöntem de dahil edilmiştir. Başarılı bir izolasyon, zenginleştirme ve koloni ayrımı için önemli olan birkaç adım vardır. Hücre izolasyonu sıçan yaparken, bir hücre süzgeç ya da kan pıhtılaşması ve kemik enkaz kurtulmak için benzer büyüklükte bir steril naylon örgü süzülmeye tavsiye edilir. Gecede hücreleri kaplama sonra, birçok ölü hücreleri orta yüzen olacak ve ölü hücreleri bağlı hücrelerin büyümesine yardımcı olacaktır taze orta yerine kaldırılır.

Bu protokol sıralama manyetik hücre olumlu bir seçimi gerçekleştirmek için nasıl açıklar ve olumsuz bir seçimi gerçekleştirmek için benzer prosedürler kullanılabilir. Eklenecek antikor miktarı farklılık gösterebilir ve optimizasyonu daha iyi bir sıralama elde etmek için gereklidir. Bu hücreler flow sitometri analizi için etiketlenmesi için de geçerlidir. Hemen etiketli örnekleri için flow sitometri analizi çalıştıran değilse, örnekler% 2'lik formaldehit ile sabit ve daha sonra çalıştırmak olabilir. Ancak, bu oto-floresan ve fedakarlık örneği kalitesini artırmak eğilimindedir beri uzun vadeli depolama tavsiye edilmez.

Koloni ayrılması için kilit rol sağ hücre yoğunluğu tohumlama (deneysel olarak optimize edilmiş olmalıdır) ve diğer klonlar ile çevrili olmayan tek klonlar yerinin olduğunu. Yakın diğer klonlar varsa, klonlama silindir yakındaki clones kapsayacak ve elde hücreleri artık bir klon olacak. Klon klonlama üzerinde silindir verirken, aynı zamanda bu hücreleri kapak ve tripsin onları ayırmak için hücrelere ulaşmasını önlemek için silikon gres klonlama silindir altındaki neden olacak gibi çanak yüzey üzerinde slayt dikkatli olun.