The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine (UCI)
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Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186, doi:10.3791/186 (2007).
तैयारी कोशिकाओं
कोटिंग HUVEC के साथ मोती - दिवस -1
0 दिन - आतंच जेल में लेपित मोती embedding
टिप्पणियाँ:
आमतौर पर, जब आतंच जेल बनाई है, आप जेल में छोटे बुलबुले देखेंगे. चिंता मत करो, वे 3-4 दिनों में गायब हो जाएगा.
मीडिया हर दूसरे दिन बदलें, यानी, 2 दिन, 4, 6, आदि ..
दिन 3 या 4 तक आप अंकुरण देख शुरू कर देना चाहिए.
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वहाँ एक से बढ़ आम सहमति है कि इन विट्रो angiogenesis assays में तीन आयामी (3 डी) एक मॉडल है जो बहुत vivo में वास्तविक पर्यावरण के लिए करीब से 2D संस्कृतियों का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है है की पेशकश है. यह स्पष्ट है कि बेहतर 3D प्रणालियों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो, और चाहिए angiogenesis के प्रमुख कदम के कई नकल करने में सक्षम हो. जबकि पिछले कई 3D assays विकसित किया गया है, इनमें से कई या तो कड़ी मेहनत से प्राप्त microvascular कोशिकाओं का उपयोग, या केवल कुछ चरणों की पुनरावृत्ति. इस वीडियो में, हम का वर्णन है और इन विट्रो angiogenesis परख है कि मानव नाल की शिरा चुनाव आयोग का इस्तेमाल करता है, जो आसानी से प्राप्य है और संवहनी अनुसंधान के क्षेत्र में सबसे अधिक इस्तेमाल किया चुनाव आयोग में अनुकूलित प्रदर्शन. परख, कई दिनों के पाठ्यक्रम पर, लगातार स्पष्ट है, पेटेंट कहनेवाला polarized चुनाव आयोग से घिरे lumens के साथ लंबे समय वाहिकाओं reproduces. चुनाव आयोग शाखाओं में बंटी और संलयन वाहिकाओं (सम्मिलन) के बाद के चरणों में भी मनाया जाता है. महत्वपूर्ण बात, इन संस्कृतियों में HUVEC morphological परिवर्तन है कि microvascular चुनाव आयोग के साथ देखा जाता है सभी से गुजरना है, या तो के vivo में या इन विट्रो में अंकुरण, प्रवास, संरेखण, प्रसार, ट्यूब गठन, शाखाओं में बंटी और सम्मिलन. समानांतर में HUVEC परिवर्तन करने के लिए, जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल और अधिक बारीकी से microvascular चुनाव आयोग की कि मैच. अंत में, हम इन विट्रो angiogenesis मॉडल में एक के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल मौजूद है कि स्मरण दिलाता है इस प्रक्रिया के कई महत्वपूर्ण चरणों.
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| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT.Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37°C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C. |
1. Nehls, V. and Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol 104:459-66. (1995)
2. Nehls, V. and Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res 50:311-22. (1995)
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ReplyPosted by: AnonymousMay 3, 2007, 1:00 PM