Optimerad Fibrin Gel Bead-analys för studier av angiogenes

FÖRBEREDELSER CELLER

1. Ta fram HUVEC och fibroblaster i M199/10% FBS / Pen-streptokock (1:100) 1-2 dagar innan beading.
2. Växla medellång till EGM-2 (Clonetics) dagen innan beading för HUVEC och dagen före bädda för fibroblaster.
3. En koncentration av ~ 400 HUVEC per pärla behövs.
4. 20.000 fibroblaster per brunn behövs.

Beläggning pärlor med HUVEC - DAG -1

1. Trypsinize HUVEC.
2. Låt kulor för att reglera (DO Centrifugera inte!). Aspirera supernatanten och tvätta pärlor kort i 1 ml varmt EGM-2 medium.
3. Blanda 2500 pärlor w / 1x10 ⁶ HUVEC i 1,5 ml varmt EGM-2 medium i en FACS-rör. Placera den vertikalt i inkubatorn. (Detta kommer att räcka för ~ 10 brunnar. Skala upp om det behövs)
4. Inkubera i 4 timmar vid 37 ° C, skaka röret var 20 min. (Bra beläggning är avgörande för groning.)
5. Efter 4 timmar, överföra belagda kulor till en T25 kolven i 5 ml EGM-2 och lämna O / N.

Bädda COATED pärlor i FIBRIN GEL - Dag 0

1. Förbered 2,0 mg / ml fibrinogen-lösning (se recept avsnitt).
2. Lägg till 0,15 enheter / ml av aprotinin till fibrinogen lösningen.
3. Överföring belagd pärlor till en 15 ml koniska rör och låt pärlor lösa. Återsuspendera pärlor i 1 mL EGM-2 och överför till en 1,5 mL centrifugrör.
4. Tvätta pärlor 3X med 1 mL EGM-2 genom att pipeting upp och ner långsamt.
5. Räkna pärlor på ett täckglas och återsuspendera i fibrinogen lösning vid en koncentration av ~ 500 pärlor / ml.
6. Lägg till 0,625 enheter / ml av trombin i varje brunn.
7. Tillsätt 0,5 mL av fibrinogen / pärla upphängning i varje brunn på en 24-brunnar.
   
   Ändra pipettspetsen för varje brunn!
   
   
8. Blanda trombin och fibrinogen genom att gå upp och ner försiktigt med pipettspetsen ~ 4 till 5 gånger. Var noga med att inte göra stora bubblor.
9. Låt plåten i 5 minuter i huven, placera den i 37 ° C-inkubator för 10-15 min att generera en propp.
10. I väntan på proppen, trypsinize fibroblaster.
11. Tillsätt 1 mL EGM-2 per brunn droppvis.
12. Seed fibroblaster på toppen av fibrin gel vid en koncentration på 20.000 celler per brunn.

ANMÄRKNINGAR:

Vanligtvis när fibrin gel bildas, kommer du att se små bubblor i gelen. Oroa dig inte, kommer de att försvinna i 3-4 dagar.

Ändra media varannan dag, dvs 2 Day, 4, 6, etc. ..

Genom dag 3 eller 4 bör du börja se groning.

Det finns en växande konsensus om att tredimensionella (3D) in vitro-angiogenes-analyser ger en modell som är mycket närmare den verkliga miljön in vivo än vad som kan uppnås med hjälp av 2D-kulturer. Det är uppenbart att överlägsen 3D-system ska vara reproducerbar, och kunna härma flera av de viktigaste stegen i angiogenes. Även om flera tidigare 3D-analyser har utvecklats, många av dessa använder antingen är svåra att få mikrovaskulära celler, eller bara sammanfatta några av de etapper. I denna video beskriver vi och utför en optimerad in vitro-angiogenes test som använder mänskliga EG navelsträng ven, som är lätt att få och den vanligaste EG i vaskulär forskning. Analysen, under loppet av flera dagar, konsekvent återger långa fartyg med tydliga, patent intercellulär lumen omgiven av polariserad EG. Senare stadier av EG förgrening och fusion av fartyg (anastomos) är också observeras. Viktigt i dessa kulturer att HUVEC genomgå alla de morfologiska förändringar som ses med mikrovaskulära EG, antingen in vivo eller in vitro, inklusive groning, migration, anpassning, spridning, rör bildande, förgrening och anastomos. Den genuttryck profil HUVEC förändringar, parallellt med närmare matchar mikrovaskulära EG. Avslutningsvis presenterar vi ett optimerat protokoll för en in vitro-angiogenes modell som rekapitulerar flera viktiga steg i denna process.