The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine (UCI)
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Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186, doi:10.3791/186 (2007).
VORBEREITUNG CELLS
COATING die Perlen mit HUVEC - Tag -1
EMBEDDING Kügelchen IN Fibringel - Tag 0
HINWEISE:
Normalerweise, wenn das Fibrin-Gel gebildet wird, werden Sie winzige Bläschen in dem Gel zu sehen. Mach dir keine Sorgen, sie werden in 3-4 Tagen verschwinden.
Ändern Sie die Medien jeden zweiten Tag, dh, Tag 2, 4, 6, etc. ..
Am Tag 3 oder 4 sollten Sie beginnen, um zu sehen sprießen.
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Es gibt einen wachsenden Konsens, dass die dreidimensionale (3D) in vitro Angiogenese-Assays ein Modell, das viel näher an der tatsächlichen Umgebung in vivo als erreicht mit Hilfe von 2D Kulturen anbieten. Es ist offensichtlich, dass überlegene 3D-Systeme sollten reproduzierbar sein, und in der Lage sein, mehrere der wichtigsten Schritte der Angiogenese zu imitieren. Während mehrerer früherer 3D-Assays entwickelt worden, viele von ihnen entweder schwer zu erhalten mikrovaskulären Zellen, oder nur zu rekapitulieren einige der Etappen. In diesem Video, beschreiben wir, und führen Sie ein in vitro-Angiogenese-Assay, der menschlichen Nabelvene EG, die leicht erhältlich und das am häufigsten verwendete EC in vaskuläre Forschung nutzt optimiert. Der Test im Laufe von mehreren Tagen, konsequent reproduziert langen Schiffe mit klaren, Patent interzellulären Lumen durch polarisiertes EG umgeben. Spätere Stadien der EG-Verzweigung und Fusion der Schiffe (Anastomose) werden ebenfalls beobachtet. Wichtig ist, dass in diesen Kulturen die HUVEC unterziehen alle morphologischen Veränderungen, die mit mikrovaskulärer EG gesehen werden, entweder in vivo oder in vitro, einschließlich sprießen, Migration, Anpassung, Verbreitung, tube formation, Verzweigung und Anastomose. Die Genexpression Profil der HUVEC Veränderungen, parallel dazu, um besser aufeinander abzustimmen, dass der mikrovaskulären EG. Abschließend präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für eine in vitro-Angiogenese-Modell, dass rekapituliert einige wichtige Etappen dieses Prozesses.
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| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT.Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115ï‚°C.6.Store it at 4ï‚°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37ï‚°C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C. |
1. Nehls, V. and Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol 104:459-66. (1995)
2. Nehls, V. and Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res 50:311-22. (1995)
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ReplyPosted by: AnonymousMay 3, 2007, 1:00 PM