La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

1. La extirpación quirúrgica de tejido ovárico

1. Preparar un nuevo lote de medio de cultivo de ovocitos (OCM; Materiales), entre 400-800 ml, dependiendo del tamaño del experimento. Ajustar el pH a 7,6-7,8, hasta que el rojo fenol se vuelve un color rojo oscuro (seis o más gotas de NaOH 5 N). Vierta una pequeña cantidad para comprobar el pH en un tubo separado desde el electrodo de pH pueden contaminar los medios de comunicación. OCM deben ser almacenados a 18 º C y utilizarse dentro de una semana.
2. Seleccione 3-5 hembras y un lugar en ~ 2L buffer solución anestésica (Materiales). Tratamos de evitar el uso de las ranas que se alimentan en el día de o antes de la cirugía. Mientras que la rana es sucumbir a la anestesia, desinfecte el área quirúrgica con un 70% EtOH y preparar los instrumentos quirúrgicos.
3. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos en 20 segundos de inmersión en un esterilizador de cuentas en caliente a 250 ° C. Los siguientes instrumentos se debe a la mano: bisturí (# 3) y la cuchilla (# 10 o 11), varios pares de Dumont pinzas, tijeras iris Bonn (curvo o recto), Halsey o Olsen Hegar porta-agujas micro, y las suturas. Coloque los instrumentos esterilizados en una placa de Petri estéril o en el interior del paquete de sutura para mantener estéril. Sujete la aguja en el soporte de la aguja en la orientación deseada antes de comenzar. Preferimos Olsen Hegar porta-agujas ya que el mango contiene las hojas de tijera, que se pueden utilizar para recortar puntos de sutura, sin instrumentos de cambio.
4. Después de 10 minutos, comprobar que un plano quirúrgico de anestesia que se ha logrado. Ranas anestesiados dejará de moverse y no responde a una pizca dedo del pie o de ser entregado. La anestesia debe durar 15 minutos, que es tiempo más que suficiente para realizar las operaciones. Don quirúrgica vestimenta adecuada. Esto puede incluir guantes limpios (sin látex), batas y máscaras quirúrgicas, dependiendo de las preferencias personales e institucionales, pautas para el cuidado de los animales.
5. Nota sobre la técnica aséptica: secreciones rana piel contienen péptidos antimicrobianos que generalmente reducen la incidencia de la contaminación durante la cirugía, a pesar de la técnica aséptica se deben seguir tanto como sea posible. Paños quirúrgicos se pueden utilizar, pero no puede ser requerido por IACUC institucional y no puede proporcionar muchos beneficios. Por lo general "la punta técnica" que se utiliza, donde las manos se toquen las puntas estériles del material de sutura instrumentos, o sitio de la incisión. Los instrumentos se pueden esterilizar (en el esterilizador de cuentas) incisión después de la piel, y un área estéril debe mantenerse en la mesa de trabajo para los instrumentos de la colocación (por ejemplo, una placa de Petri o un paquete de sutura). Requisitos institucionales pueden diferir de manera significativa, así que por favor siga las pautas de sus instituciones y reciben instrucción adecuada antes de realizar cirugías.
6. Retire la rana de la anestesia y el lugar en decúbito dorsal sobre una cirugía húmeda limpie. Tenga en cuenta. La piel puede ser limpiado por lavado de yodo povidona diluida (1:20) o clorhexidina (0,75%). Sin embargo, evite comerciales lavado quirúrgico, los jabones y el 70% de alcohol isopropílico, ya que pueden dañar la delicada piel de los anfibios.
7. Utilizando unas tijeras iris bisturí o pequeño, hacer un pequeño (1 a 1,5 cm) incisión en la piel en la parte inferior del abdomen, lateral a la línea media. Incisiones posteriores sobre la misma rana se debe realizar en lados alternos, bien separados uno del otro. Las incisiones se pueden hacer en forma paralela o perpendicular a la línea media.
8. Hacer que la piel y las incisiones abdominales del músculo en dos etapas. Después de cortar la piel, elevación de la capa muscular y los alrededores de color blanco fascia con pinzas y hacer la incisión en el músculo planteadas. Usar tijeras y cortar hacia abajo, tratar de hacer un corte rápido para exponer la cavidad del cuerpo dejando los bordes limpios herida. Si sólo la fascia se corta, se retrae y se hace más difícil la sutura. Levantamiento de los músculos le ayudará a evitar que sin querer herir a cualquiera de los órganos internos. Además, trate de evitar el corte a través de cualquier corazones linfáticos visibles o los vasos sanguíneos dentro de las capas musculares. Ampliar la longitud con una tijera de la incisión para que el ovario se pueden arrancar fácilmente a través.
9. Ovario deben ser claramente visibles una vez hecha la incisión. Para obtener el ovario, tome con pinzas y externalizar el tejido ovárico. La cantidad deseada de tejido, y recorta en el nivel de la pared del cuerpo. No rellene el tejido en la cavidad celómica, ya que esto podría ser una fuente de infección u otras complicaciones.
10. Inmediatamente observar un pequeño trozo de ovario en un microscopio y un defolliculate pocos ovocitos para probar su calidad. Se debe ser firme y de tamaño uniforme y la coloración. Si son aceptables, eliminar la cantidad deseada de tejido ovárico y la sutura de la incisión. Suficiente para llenar una caja de Petri de 90 mm es suficiente para la mayoría de los experimentos. Si los ovocitos son de dudosa calidad, la sutura de la rana y repetir con una mujer diferente.
11. Cerrar la incisión suturando el músculo y la capa de fascia en primer lugar. Inserte el n Eedle unos pocos milímetros lateral de la incisión, asegurándose de que pase a través de la capa de la fascia también. Suturas sólo a través del músculo puede desgarrar el tejido y se suelte. El uso de fórceps para ayudar a insertar la aguja desde abajo en el lado opuesto de la incisión. Liberar y volver a agarrar la aguja desde el exterior del cuerpo y tirar de la sutura a través de hasta varios centímetros o menos de la cola se mantiene, teniendo cuidado de no tirar de él hasta el final.
12. Cerrar la herida con un patrón simple de sutura interrumpida. Nosotros usamos un empate instrumento básico para hacer nudos cuadrados cirujano (nudos de arrecife). Pase el extremo largo de la sutura alrededor del soporte de la aguja, sujete la cola y tire de ella a través del lazo hacia usted y apriete. Lazo y tire a través de nuevo, esta vez sacar el porta-agujas lejos de ti. Un tercer lanzamiento se puede utilizar para aumentar la seguridad (en la misma dirección que el primero). Recorte de la sutura, dejando la cola corta y hacer otra sutura en el músculo de unos pocos milímetros de distancia. Dos puntos de sutura son suficientes para pequeñas suturas, tres de los más grandes. Repita el procedimiento para la capa de la piel. Demostraciones en video de la técnica de sutura básicos están disponibles en YouTube - búsqueda de "empate instrumento", hay un buen número para elegir, aunque la técnica básica es la misma.
13. Enjuague la hembra con agua destilada y colocarla en un balde lleno de recuperación de frío (18 ° C). Mientras que en el laboratorio, las ranas se mantienen en el agua del grifo tratada con Amquel para eliminar las cloraminas. Cada pocos minutos, levante suavemente la rana en el agua y buscar tragar o movimientos de ojo saltón, indicativo de la recuperación de la anestesia.
14. Nota: La cirugía de la supervivencia no es estrictamente necesario para obtener tejido ovárico, aunque las mujeres se siguen produciendo ovocitos después de un buen número de operaciones. Realizar la cirugía de supervivencia también se reducirá el número de animales utilizados. Asegúrese de seguir las pautas de su unidad de cuidado de los animales vertebrados en los métodos de supervivencia de la cirugía, el cuidado post-operatorio y el seguimiento y el número de cirugías permite a un individuo.

2. El cultivo de ovocitos y Defolliculating

1. Justo después de terminar la cirugía, subdividir el ovario en trozos pequeños (~ 2 cm ²⁾ y guardar en OCM fresco, con 5-6 piezas por caja de 90 mm. Lóbulos individuales de ovario son a cielo abierto, aplanado y corte en trozos cuadrados. Estos se lavan en OCM limpia y se coloca en los platos de la cultura. Aplanamiento y dividir el ovario va a extender su vida en la cultura y hacer más fácil defolliculation.
2. Mover un lóbulo de un plato pequeño de OCM y de forma manual defolliculate 300-500 ovocitos. Transferencia de ovocitos utilizando una aguja estéril, pulido al fuego pipeta. Hemos encontrado que el uso de la variedad de algodón conectado es esencial para minimizar la contaminación de los cultivos. Tienda de los ovocitos a 18 ° C en 8 ml OCM (en medio de los platos (Falcon 1007)) en grupos de 100 a 150. Con la práctica, debe ser capaz de defolliculate ovocitos suficiente en 1-2 horas. Ovocitos Collagenased no son adecuados para la transferencia de sede, ya que no se puede fertilizable.
3. Defolliculating método. Nos defolliculate el uso de fórceps relojeros "(Dumont # 4 o # 5 años, Herramientas de Bellas Ciencia), siguiendo los métodos básicos que se describen en Smith et al., (1991). Usando un par de pinzas (en su mano dominante), agarrar la capa de teca tejido conectivo que rodea un ovocito totalmente crecido etapa VI, cerca de donde el folículo está unido al ovario (el tallo). Con el otro par de pinzas, sujete el ovario adyacente a la primera pareja. Ligeramente rasgar la capa del folículo tirando a través de los ovocitos. Suavemente burlarse de los ovocitos de los tejidos. Ovocitos con éxito defolliculated se floppier que los ovocitos sólo logró sin la eliminación de la capa del folículo y se carece de vasos sanguíneos visibles.
4. Nota: es esencial para mantener una presión muy leve en las puntas de la pinza, apenas suficiente para las puntas de cumplir. Agarre demasiado fuerte es común entre los principiantes y se traducirá en el ovocito se apartó con el folículo intacto. Mantenga un buen par de pinzas en exclusiva para defolliculating. Los consejos deben cumplir con precisión y debe ser un poco más contundente que la pinza para la toma de explantes de embriones de Xenopus (Figura 1).
5. De manera rutinaria la prueba maduros alrededor de 20 con la progesterona y abortar el experimento, si el ritmo de maduración es pobre (<50% después de 6-7 horas a temperatura ambiente).
6. En este punto, los ovocitos pueden ser manipuladas y cultivadas como se desee, tales como la microinyección de oligo, morfolino o ARNm. Los procedimientos de inyección variar según el laboratorio, por lo que no se describen los que están aquí. Los ovocitos se puede mantener hasta por una semana en la OCM, pero en general la salud declina así que lo mejor es utilizarlos para la transferencia de un plazo de 96 horas de aislamiento.
7. Tenga en cuenta que sólo entre cinco y seis grupos (incluido el control) puede ser transferido a una sola hembra, debido a las limitaciones de colorantes vitales, por lo que planificar sus experimentos en consecuencia.

1. Si se realiza un rescate de agotamiento de oligo, inyecte el ARNm (generalmente 50-300 pg de ARN) ~ 24-48 horas después del oligo. Los oligos se han degradado en ese momento y no debe afectar a la ARN inyectada.
2. En la tarde antes de realizar la transferencia, añadir 16 l de solución de progesterona de trabajo (de 1 mm de EtOH) a los ovocitos en el OCM 8 ml en placas de medio (concentración de progesterona final es ~ 2 M). Incubar 10-12 horas a 18 ° C para permitir la maduración de los ovocitos.
3. Inyectar 3-5 hembras con 1000 unidades por la rana de hCG para inducir la puesta de huevos. Nuestros experimentos parecen funcionar mejor si la maduración de ovocitos y la inyección de hCG se realizan al mismo tiempo, unas 12 horas antes de la implantación en el receptor (por ejemplo, 22:00 PM -10). Deja las mujeres a temperatura ambiente y 18 ° C durante la noche.

4. Preparación y tinción colorante vital de ovocitos

1. En la mañana de la transferencia, permiten ~ 45-60 para configurar y realizar el procedimiento. En este punto, los ovocitos maduros pueden ser congelados para su posterior análisis de la eficacia de la caída del mRNA o la expresión de proteínas. Además, comprueba que los ovocitos no se han infectado y que hubo una tasa de buena maduración (> 50%). Oocitos infectados no van a fertilizar. Descongele los colorantes vitales (materiales) y giran a velocidad máxima durante 5 min.
2. Color de los diferentes grupos experimentales mediante la adición de 80 l del colorante apropiado vital (s) a los platos de los ovocitos y se incuban con la oscilación de 15 '. Durante este tiempo, seleccione una mujer de acogida y comenzar la anestesia. Elija una rana que poco a poco va poniendo los huevos normalmente o que produce huevos con abundante apretando suave. Los huevos del huésped debe ser de buena calidad. Evite las hembras que están poniendo las cadenas de huevos o huevos aplastados.
3. La transferencia de los huevos de color a un plato grande de OCM fresco, remolino brevemente para lavar y dejarlos a un lado antes de la transferencia.
4. Prepare una pipeta Pasteur con un agujero lo suficientemente ancha como para dar cabida a un ovocito (alrededor de 1,5 mm) para su uso en el trasplante de los ovocitos. Puntuación de la pipeta con un lápiz de diamante y se rompen limpiamente. Fuego de uñas hasta que los bordes son lisos, teniendo cuidado de no derretir la abertura cerrada.

5. Realizar el trasplante de ovocitos

1. El trasplante de ovocitos utiliza los mismos procedimientos quirúrgicos como se describe en la Parte I, aunque en lugar de la eliminación de ovarios, oocitos manipulados se introducen en la cavidad del cuerpo con una pipeta. Idealmente, el proceso de transferencia debe realizarse lo más rápidamente posible y el tamaño de la incisión debe ser lo más pequeña posible.
2. Anesthesize la hembra de acogida y la elaboración de instrumentos quirúrgicos como se describe en la Parte I. Marca y la incisión como se describe en la Parte I. La incisión puede ser más pequeño, pero tiene que ser lo suficientemente grande como para caber el diámetro de la pipeta de transferencia (Figura 2).
3. Para trasplantar los ovocitos, captar y elevar un colgajo de músculo y fascia con pinzas y se introducen los ovocitos experimental con la pipeta Pasteur preparada anteriormente. Agite el plato de los ovocitos para reunirlas en el centro y aspirar la mayor cantidad posible. Permita que los oocitos de asentarse en el extremo de la pipeta para evitar el exceso de líquido que se introduce y inserte la punta de la pipeta en la incisión y permiten lentamente los ovocitos a llegar a la cavidad del cuerpo (Figura 2B). Repita hasta que todos los ovocitos han sido transferidos. No suelte la capa muscular en cualquier momento, hasta que haya comenzado la sutura, o los ovocitos se derrame fuera de la incisión.
4. Una vez que los ovocitos han sido transferidos, sujete ambos lados de la incisión con unas pinzas y ponerlos juntos, permitiendo que los ovocitos se asiente en la cavidad del cuerpo. Comience sutura como se describe, teniendo cuidado de mantener la tensión al alza sobre el músculo y la fascia hasta el primer nudo se ata (Figura 2C). Esto evitará que los ovocitos de ser expulsado y se permita que los bordes de la incisión para sanar de manera uniforme. Añadir otra sutura en la capa muscular / fascia y sutura de la piel.
5. Enjuague la hembra con agua destilada y colocarla en un balde lleno de recuperación de refrigeración (18 ° C) Amquel de agua tratada. Vigilar su recuperación de la anestesia que el anterior. Debe comenzar a poner huevos normalmente después de la operación.
6. Obtener los testículos de una rana macho con los procedimientos normales. Tienda de los testículos en el OCM o L15 hasta que sea necesario. Nosotros preferimos los testículos frescos al fertilizar experimentos de transferencia.

6. La recuperación de ovocitos in vitro y en la fertilización

1. Cilios peritoneal impulsará los huevos transferidos (normal y los huevos celómico del host) a las aberturas de los oviductos en la parte anterior de la cavidad del cuerpo. Huevos de color pueden ser recuperados a partir de 2-3 horas después de la transferencia apretando normal. Los huevos pueden ser obtenidos cada media hora o más hasta que la mujer deja de poner.
2. Fertilizar en una espesuspensión rm (en ~ 4 MMR ml 1x) durante 4 minutos. Inundaciones y enjuagar ampliamente con MMR 0.1x. Los huevos deben activar con normalidad y se empiezan a romper ~ 1.5-2 horas después de la fecundación. Huevos transferidos a menudo se rompen un poco más tarde que los huevos de acogida.
3. Retire las capas de gelatina con cisteína como embriones normales y ordenar en platos separados. Esto se puede hacer en cualquier momento, dependiendo de las necesidades del experimento. Es generalmente más fácil identificar los diferentes colores alrededor de la fase de 4 células, y más difícil durante las últimas etapas de blástula. La cultura de los huevos con una densidad baja (<50 por plato mediano) en MMR 0.1x limpio. Desde este punto, los embriones pueden ser tratados y manipulados con normalidad.
4. Volver a las ranas a las instalaciones de los animales y vigilar las complicaciones durante los próximos días.
5. Método de fertilización alternativa, la puesta de huevos en un tampón de sal
   1. Después de la rana se ha recuperado de la anestesia, su lugar en ~ 1L alto contenido de sal MMR (1.2x). Deje que la hembra ponga los huevos en el buffer de alrededor de 4-6 horas. Apriete los huevos restantes a cabo, la fuga de MMR 1,2 x y clasificar huevos de colores en el plato limpio, eliminar todo el líquido posible.
   2. Lavar exhaustivamente con MMR 0.3x y fertilizar en el volumen mínimo de 0.3x MMR / esperma suspensión hasta que los huevos activar (10 minutos). Inundaciones con MMR 0,1 x y la cultura que el anterior. Esta opción es útil si los huevos son necesarios en la misma etapa o si la extracción manual de los huevos de los daños de los ovocitos de donantes.

Un éxito de la transferencia dará lugar a la fecundación y la división normal de> 50% de los ovocitos (Figura 3). Generalmente entre 30-60% de los ovocitos transferidos sobreviven más allá de las etapas Néurula. Por lo general, la transferencia de ovocitos desde 75 hasta 150 por grupo experimental, que dará embriones suficiente para varios tipos de análisis (in situ, RT-PCR), así como visualizar el fenotipo. La implantación de ovocitos mucho más no parece aumentar considerablemente el rendimiento. Además, por lo menos 30 ovocitos por cada grupo deben ser transferidos a garantizar que al menos algunos lo hacen a través de la gastrulación. Los colorantes vitales en general, no afectan a los embriones en las concentraciones y las condiciones aquí descritas, aunque los colorantes pueden tener efectos adversos en ciertas situaciones. Clásicamente, Neutral Red se ha reportado que tiene propiedades fototóxicas cuando se expone a fuertes fuentes de luz de tungsteno base. Más recientemente, Mir y Heasman (2008) han informado de que Bismarck Brown puede tener algunos efectos tóxicos si los embriones se incuban a temperaturas bajas. Precauciones básicas como no excesivamente muriendo los ovocitos y evitar los extremos de la temperatura y la iluminación debe eliminar la posibilidad de vital importancia para los efectos secundarios del tinte.

Los mayores determinantes en el éxito o el fracaso del método son la calidad de los ovocitos de donantes y la hembra de acogida. No existe un método infalible para determinar si un lote particular de los ovocitos se fertilizan así. Ovario con un alto porcentaje de ovocitos atrésicos se debe evitar. Además, hemos tenido poco éxito con el ovario que está muy vascularizada, lo que posiblemente indica que la reabsorción está ocurriendo. Los ovocitos se debe guardar en ° C como máximo 18 años y otra mantener en buenas condiciones como los ovocitos no fertilizar si está infectado o dañado. También parece ser, en nuestro laboratorio, que se obtienen mejores resultados cuando el defolliculator tiene más experiencia y puede aislar e inyectar un gran número de ovocitos en un corto período de tiempo. Del mismo modo, se debe tener cuidado para seleccionar los anfitriones con los huevos sanos, aunque nunca está seguro de que una rana determinado que un buen anfitrión. Al igual que con defolliculating, la habilidad del cirujano también tiene una incidencia en el éxito del procedimiento. Minimizar el tiempo que esté anestesiado el anfitrión parece esencial para la recuperación eficiente y la fertilización.

El calendario general de los distintos procedimientos es fundamental para el éxito de los experimentos de transferencia de ovocitos. En general, cuanto menor sea el tiempo de los ovocitos se mantienen en cultivo, mejor es la fertilización en general y la salud de los embriones serán. Para los experimentos de caída de ARNm utilizando oligonucleótidos antisentido, los ovocitos deben ser cultivadas al menos 24 horas después de la inyección oligo para permitir el agotamiento máximo de la meta del mRNA y la rotación del oligo. Así, los ovocitos deben ser defolliculated tan pronto como sea posible y se inyecta el mismo día. Un experimento típico podría comenzar el lunes con el aislamiento de los ovocitos y la inyección, seguida de la maduración y la estimulación de las mujeres en la noche del martes, y la transferencia de la mañana del miércoles. Si la cifra de negocios ARN objetivo es lenta o no es la proteína abundante materna, el período de cultivo se puede extender a 48 o incluso 72 horas. Contamos con el mejor éxito cuando los ovocitos son transferidos dentro de las 12 horas de tratamiento con progesterona. Sobremaduro ovocitos comienzan a deteriorarse y, en general fertilizar mal. Por lo general, añade la progesterona y se inyectan las mujeres con hCG unas 12 horas antes de realizar la transferencia, tanto con los ovocitos de ranas y mantiene a ~ 18 ° C durante la noche.

Aunque el método de transferencia de acogida es una labor intensiva al principio, los conocimientos básicos necesarios se pueden adquirir sin mucha dificultad. El uso más común de este método consiste en fecundar los ovocitos que se agotaron de determinados mRNAs materna por inyección oligonucleótidos antisentido. Otras manipulaciones como la sobreexpresión de ARNm o de tratamiento de drogas también se puede realizar. Estos a menudo puede tener resultados diferentes en comparación con la fecundación después de la inyección, debido a una mayor expresión o función diferencial en los huevos frente a los embriones. E-cadherina sobreexpresión (. Heasman et al, 1991) y ultravioleta irradiación (Holwill et al, 1987;. Elinson y Pasceri, 1989) son dos ejemplos interesantes. Los resultados preliminares de nuestro laboratorio sugieren que los métodos de transgénesis con la integrasa inyectada o meganucleasas puede trabajar más eficientemente en los ovocitos también.

La técnica de transferencia de acogida permite la experimentación, tanto en las etapas pre-y post-fecundación y por lo tanto puede ayudar a comprender que no es posible en otros organismos o incluso por buscar únicamente en los eventos posteriores a la fecundación en Xenopus. Dada la importancia de la madre vías de señalización en el desarrollo y la dificultad y el costo de generar mutaciones materna en vigor en los vertebrados, este método es probable que siga siendo una herramienta útil en la investigación del desarrollo temprano.

7. Representante Reresultados

Figura 1. Ejemplos de buenas prácticas (arriba) y mala (abajo) pinzas para defolliculating.

Figura 2. La transferencia de ovocitos cultivados en una hembra de acogida. (A) una pequeña incisión en el abdomen inferior de la rana de acogida. La capa muscular se eleva ligeramente para permitir la introducción de los ovocitos. (B) los ovocitos son vitales teñidos y se coloca en la cavidad del cuerpo a través de la incisión. (C) la terminación de la sutura inicial en la capa muscular.

Figura 3. Ejemplos de división, los ovocitos transferidos en la etapa de 8-16 células, tras la retirada de las capas de gelatina.