Identificación de los fenotipos de inhibición del crecimiento inducida por la expresión de tipo bacteriana efectores III en la levadura

I. Diseño de un sistema de expresión de levadura para el tipo de efectores III

Calibración de un sistema de levadura adecuada para la expresión del tipo III efector (s) de interés es una tarea importante y puede requerir alguna prueba y error. Factores de mayor relevancia que deben ser considerados y optimizar el diseño de este sistema son: 1) el promotor dirige la expresión de los efectores (s), 2) el número de copias del gen efector, 3) la etiqueta de epítopo utilizado para verificar la expresión de proteínas y 4) la cepa de levadura.

1) Promotor

Debido a que las bacterias de tipo III efectores pueden ser tóxicos para las células de levadura, un promotor inducible se debe utilizar para el control de su expresión. El promotor GAL1 se utiliza comúnmente para este propósito y su actividad está regulada por la fuente de carbono presente en el medio de cultivo: es reprimida por la glucosa y la inducida por galactosa. Sin embargo, este promotor fue reportado como poco fugas en las condiciones que resulta en la represión de la toxicidad no deseada. Si un problema similar que se encuentre, es aconsejable reducir al mínimo el número de copias del gen efector como se describe a continuación, o utilizar los promotores alternativos inducible, como el MET3 o promotores CUP1 ^1. A continuación se describen los procedimientos para la expresión de proteínas efectoras de un promotor inducible por galactosa.

2) Gen número de copias

Otro parámetro que afecta el nivel de expresión de la proteína es el número de copias del gen efector presentes en la célula. Altos niveles de expresión se logra cuando el gen efector es llevada por un 2. Micrones plásmido (40-60 copias por célula) Expresión intermedia se obtiene mediante el uso de un centrómero, que contiene el plásmido (1-3 copias por célula), mientras que una baja expresión se logra cuando el gen efector se integra en el genoma de la levadura por recombinación homóloga. Mediante la combinación de un vector que contiene centrómero y el promotor GAL1 hemos expresado con éxito alrededor de 50 efectores de la planta de agentes patógenos Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria y Pseudomonas syringae pv. Tomate en niveles detectables por los análisis de inmunoblot y con fugas insignificantes en condiciones de represión (Salomon y Sessa , sin publicar).

3) epítopo etiqueta

Si los anticuerpos contra el efector de interés no están disponibles, una etiqueta de epítopo se fusiona con la proteína efectora para controlar su expresión por inmunoblot. Etiquetas de uso general son Myc, la hemaglutinina (HA) o de la bandera, a la que seguro anticuerpos comerciales disponibles. Le recomendamos que utilice sólo una copia de la etiqueta para reducir al mínimo los efectos nocivos no deseados en la estructura y la actividad de la proteína efectora.

4) cepa de levadura

Un requisito fundamental para la cepa de levadura que se utiliza para la expresión es auxotrofía para el marcador de selección del vector de expresión. Es importante señalar que las diferentes cepas de levadura puede mostrar diferentes sensibilidades a la expresión de ciertos efectores. Por ejemplo, se observó que el W303 y BY4741 cepas tienen diferentes sensibilidades a varios efectores Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria (Salomon y Sessa, sin publicar). Por lo tanto, es preferible poner a prueba el efector (s) de interés en diferentes cepas de levadura.

II. Preparación de los medios de comunicación de levadura

Para el crecimiento de cepas de levadura que no contiene ningún vector, el uso YPD (10 g / L de extracto de levadura, 20 g / L de peptona y 2% [w / v] glucosa) como el medio de cultivo. Para los medios de comunicación sólidos, añadir un 2% [w / v] de agar para la solución (si el medio sólido es muy suave, añadir 0,05% [v / v] de una solución de NaOH 5 N acciones en el medio antes de esterilizar). Se recomienda preparar el medio sin glucosa en el 90% del volumen final y autoclave ella. Poco antes de su utilización, llenar el volumen al 100% con un filtro esterilizado 20% [w / v] una solución de glucosa (la disolución de glucosa al 20% a los 4 ° C para evitar la contaminación).

Para el crecimiento de cepas de levadura que contiene un vector que proporciona prototrofía a un marcador de selección (leucina, uracilo, histidina y triptófano), el uso sintético de abandono medio sin leucina, uracilo, histidina y triptófano (6,7 g / L de levadura base de nitrógeno sin aminoácidos , 1,4 g / L de levadura sintética de abandono suplemento de medio) y que contiene un 2% [w / v] de glucosa, o un 2% [w / v] galactosa y el 1% [w / v] rafinosa. Para los medios de comunicación sólidos, añadir un 2% [w / v] de agar para la solución. Se recomienda preparar el medio en el 90% del volumen final y autoclave ella. Poco antes de su utilización, llenar el volumen al 100% con una solución de glucosa esterilizada por filtración, 20%, o galactosa, esterilizada por filtración del 20% + 10% de solución de rafinosa, dependiendo de la fuente de carbono deseado (mantener la glucosa en un 20% y el 20% galactosa + 10% rafinosa soluciones a 4 º C para evitar la contaminación). Dependiendo del marcador de selección de los vectores de expresióntor, añadir los otros aminoácidos o uracilo antes de su uso (10 ml / L de un 1 g/100 ml de archivo leucina, 10 ml / L de un stock de 200 mg/100 ml uracilo, 2 ml / L de un 1 g/100 ml de caldo de histidina, o 2 ml / L de un 1 libre g/100 ml de triptófano). En la preparación de las poblaciones de leucina y uracilo, a esterilizar en autoclave y conservar a temperatura ambiente. En la preparación de las poblaciones de histidina y triptófano, esterilizarlos mediante el filtrado, envuelva la botella con papel de aluminio para protegerlo de la luz, y mantenga a 4 ° C. En los procedimientos se describen a continuación, sintéticas deserción medio suplementado con leucina, uracilo, histidina y triptófano, es designado como un medio completo sintético.

Los medios de comunicación sólido placas pueden almacenarse hasta por dos meses a 4 ° C. Antes de su uso, secar las placas durante 20 minutos en una campana de flujo laminar estéril a temperatura ambiente.

III. Transformación de la levadura

1. Antes de iniciar el procedimiento de transformación de la levadura, preparar las tres soluciones siguientes: un 50% [w / v] de polietilenglicol (PEG) 3350 solución, una solución de 1 M pH = 8,0 LiAc, y una solución de TE (100 mM Tris pH = 6.85 y 10 mM EDTA pH = 8,0). Filtro-esterilizar las soluciones y mantener a 4 ° C.
2. El uso de un mango largo de madera o un asa de siembra estéril, elegir una colonia de levadura (1-2 mm de diámetro) de una placa fresca e inocular 3 ml de YPD en un tubo de polipropileno de 15 ml. Vortex brevemente. Coloque el tubo de la cultura en un rodillo y se incuba durante la noche a 30 ° C con rotación constante.
3. Por la mañana, eliminar la cultura de los rodillos y se centrifuga a 800 g por 5 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, eliminar completamente el sobrenadante.
4. Resuspender las células en un tampón de resuspensión ml (10% [v / v] TE solución, el 10% [v / v] 1 M solución LiAc) y mezclar mediante agitación.
5. Para cada plásmido se transformó y una transformación adicional de control, la transferencia de 100 l de la suspensión celular a un microtubo.
6. Para cada tubo, añadir 5 l de ADN de esperma de una sola cadena de salmón (10 mg / ml) y 250-500 ng de ADN de plásmido a ser transformado (a excepción del tubo de control).
7. Añadir con cuidado a cada tubo 650 l de solución de transformación (10% [v / v] TE solución, el 10% [v / v] 1 M solución LiAc, el 80% [v / v] del 50% [w / v] solución de PEG ) y agitar.
8. Se incuba a 30 ° C durante 30 minutos en un rodillo.
9. Retire los tubos de la coctelera, añadir 70 l de DMSO, y mezclar invirtiendo los tubos de 10-15 veces (no vortex para evitar la ruptura de las células).
10. Colocar los tubos en un 42 ° C precalentado baño de agua y se incuba durante 15 min.
11. Retire los tubos del baño de agua e inmediatamente colocarlos en hielo durante 2 min.
12. Una vez que los tubos se han enfriado, a centrifugar a 800 g por 5 min a temperatura ambiente.
13. Tomar los tubos de la microcentrífuga y retirar con cuidado el sobrenadante viscoso con una pipeta.
14. Resuspender el botón celular de cada tubo de 150 ml de agua estéril bidestilada (DDW), y se extendió la suspensión de células en una placa de medio sintético completo que contiene 2% de glucosa como fuente de carbono y sin aminoácidos o nucleótidos a la que proporciona el plásmido prototrofía.
15. Deja abiertas las placas durante 2 minutos y dejar que se sequen en una campana de flujo laminar. Coloque las placas en una incubadora de 30 ° C durante dos o tres días.
16. Una vez que las colonias (1-2 mm de diámetro) han aparecido en los platos, recoger aproximadamente 10 colonias aisladas de cada transformación y la transferencia a un plato dulce. Cuando la transferencia de las colonias, que los parches de 2 cm x 2 cm para permitir el crecimiento de una gran cantidad de células de levadura. Las placas se incuban en una incubadora a 30 ° C durante dos días.
17. Cuando los parches de la levadura ha crecido, quitar las placas de la incubadora y sellar con parafilm. Las placas pueden guardarse a 4 ° C. Transferencia de las colonias de una placa fresca cada 10-14 días.

IV. Preparación de un extracto de proteína de levadura para verificar la expresión de Efectos por inmunoblot

1. Elija una colonia de levadura (1-2 mm de diámetro) de una placa fresca de un tubo de polipropileno de 15 ml que contiene 3 ml de la correspondiente medio sintético completo suplementado con 2% de glucosa como fuente de carbono y sin aminoácidos o nucleótidos a la que el plásmido de elección ofrece prototrofía. Coloque el tubo de la cultura en un rodillo y se incuba durante la noche a 30 ° C.
2. Al día siguiente, eliminar la cultura de los rodillos y se centrifuga a 800 g por 5 min a temperatura ambiente. Retire los tubos de la centrífuga y descartar el sobrenadante.
3. Resuspender el botón celular en 3 ml de DDW estéril y mezclar mediante agitación.
4. Centrifugar de nuevo, deseche las células sobrenadante y resuspender en 3 ml de DDW estéril.
5. Transferencia de 200 l de la suspensión de células a un tubo de 15 ml nuevo que contiene 3 ml de medio sintético completo suplementado con 2% de galactosa y 1% de rafinosa como fuente de carbono, y sin aminoácidos o nucleótidos a la que el plásmido de elección ofrece prototrofía.Mezclar mediante agitación, en lugar de un rodillo, y se incuba durante la noche a 30 ° C.
6. En la mañana siguiente, la transferencia de 1 ml de la cultura (o más de las culturas de baja densidad) en un microtubo. Recoger las células por centrifugación a 800 g por 5 min a temperatura ambiente.
7. A partir de aquí, trabajar en una campana extractora para evitar respirar β-mercaptoetanol vapores tóxicos. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y resuspender el botón celular en 100 l de helado de solución de lisis (4% [v / v] 5 N NaOH, 0,5% [v / v] β-mercaptoetanol). Mezclar enérgicamente por agitación e incubar en hielo durante 30 min.
8. Durante la incubación, determinar el volumen de HCl (6 N) necesarios para la titulación de 100 l de tampón de lisis a pH 9.10. Con este fin, el lugar 10 microtubos en un estante y la transferencia de 100 l de la solución amortiguadora de lisis en cada una de ellas. Añadir varios volúmenes (1-10 l) de HCl (6 N) a cada tubo y mezclar mediante agitación. Tomar una muestra y comprobar el pH de la solución con una tira de indicador de pH.
9. Al final de la incubación, añadir el volumen de HCl determinado en el paso anterior al lisado y mezclar mediante agitación (para una mayor precisión, el lugar de la solución de HCl en el lado del tubo sin necesidad de insertar la punta en el lisado).
10. Añadir 50 l de tampón de muestra de 3x (30% [v / v] de glicerol, el 15% [v / v] β-mercaptoetanol, el 37,5% [v / v] 500 mM Tris-HCl pH = 6,8, un 0,15% [w / v ] dodecil sulfato [SDS] y algunos granos de azul de bromofenol) al lisado y mezclar mediante agitación (si la solución se vuelve amarilla, significa que el pH es muy bajo, y unos pocos microlitros de solución de lisis hay que añadir hasta que la solución vuelve de color azul).
11. Hervir la solución de lisado durante 5 minutos en un bloque de calentamiento después de perforar un agujero en la tapa del microtubo con una aguja.
12. Retire el microtubo del bloque de calentamiento y dejar enfriar durante 2 minutos a temperatura ambiente.
13. Vortex la solución de lisado y luego de girar durante 10 segundos. Carga de 30 l en un gel de SDS-PAGE para el análisis de inmunoblot.

V. Detectar ensayo para la detección de Efectos inducidos por Fenotipos inhibición del crecimiento

1. A partir de una placa fresca escoger una colonia de levadura (1-2 mm de diámetro) que lleva el plásmido de expresión de interés y se inoculan en un tubo de polipropileno de 15 ml, 3 ml de medio sintético completo suplementado con 2% de glucosa como fuente de carbono y sin el amino ácidos o nucleótidos a la que el plásmido de expresión proporciona prototrofía. Repita el mismo procedimiento para el control de una cepa de levadura que lleva un plásmido vacío. Coloque los tubos de cultivo en un rodillo y se incuba durante la noche a 30 ° C con rotación constante.
2. Al día siguiente, retire las culturas de los rodillos y se centrifuga a 800 g por 5 min a temperatura ambiente. Retire los tubos de la centrífuga y descartar el sobrenadante.
3. Resuspender el botón celular en 3 ml de DDW estéril y mezclar mediante agitación.
4. Repita el paso de centrifugación y suspender las células en 3 ml de DDW estéril.
5. Para determinar la densidad óptica (DO), la transferencia de 100 l de cada cultura a un microtubo contiene 900 l DDW y agitar. Vierta el contenido de los tubos en una cubeta de plástico y mide la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm (usar como referencia una cubeta llena con 1 ml de DDW). Calcular el diámetro exterior de ₆₀₀ de los cultivos iniciales multiplicando el diámetro exterior de ₆₀₀ de las culturas en la cubeta por un factor de dilución de 10.
6. A continuación, basado en el diámetro exterior de ₆₀₀ de los cultivos iniciales, preparar suspensiones celulares (1 ml) con un OD ₆₀₀ = 1,0 en microtubos estériles.
7. Mediante el uso de 3 microtubos estériles llenos con 900 l DDW estéril, la preparación de tres a 10 veces diluciones seriadas (OD ₆₀₀ = 0,1, 0,01 y 0,001) de cada una suspensión de células (OD ₆₀₀ = 1,0), preparado en el paso anterior.
8. Se preparan dos placas que contienen medio completo sintético sin aminoácidos o nucleótidos a la que el plásmido de elección ofrece prototrofía. El medio de una placa debe ser complementado con un 2% de glucosa y la de la otra placa con 2% de galactosa y 1% de rafinosa. Secar las placas en una campana de flujo laminar estéril a temperatura ambiente durante 20 minutos y colocarlos en una rejilla.
9. Para cada cultura, punto 10 l de las cuatro diluciones en una fila a ambos la represión y la inducción de los medios de comunicación.
10. Después de ver, dejar las placas en el capó abierto durante varios minutos. Cuando los puntos están secos, cubrir las placas y colocarlas en una incubadora de 30 ° C durante 2-3 días.
11. Después de la incubación, sacar las placas y analizar el crecimiento de la levadura. En primer lugar, confirmar que las densidades celulares son similares en la placa que contiene medio de la represión. A continuación, comparar el crecimiento de la cultura que expresa la proteína efectora de interés con la cultura que lleva un vector vacío en la placa que contiene medio de inducción.
    
    Nota: los efectores pueden orientar los procesos celulares que no se limita la velocidad de crecimiento de la levadura en condiciones estándar de laboratorio el crecimiento.Para permitir la identificación de los fenotipos de la inhibición del crecimiento de los efectores tales, los medios de comunicación inducen pueden complementarse con los compuestos que alteran las funciones celulares de levadura, lo que aumenta su sensibilidad a los efectores. Para obtener una lista de productos químicos que posiblemente pueden ser integrados en este procedimiento, se refieren a Parsons et al. (2004) ^2.

VI. Resultados representante

Un representante de la levadura manchado análisis y detección de los fenotipos de la inhibición del crecimiento inducida por la expresión de efectores tipo III se muestra en la figura. 1. En este experimento, el tipo III efectores AvrPto, HopAA1-1 y AvrE1 de los Gram-negative bacteria fitopatógenas Pseudomonas syringae pv. Tomate (Pst) se expresaron desde el centrómero pGML10 plásmido que contiene la cepa de levadura BY4741, y la prueba de su capacidad para inhibir el crecimiento de la levadura. Las diversas culturas de levadura que expresan Pst efectores tipo III bajo el control de la galactosa inducible GAL1 promotor o contiene un vector vacío se diluye en serie y se colocaron en la represión (glucosa) o la inducción (galactosa) los medios de comunicación (Fig. 1). En medio de la represión, las cepas de levaduras llevar plásmidos para la expresión de AvrPto y HopAA1 1-mostraron un crecimiento similar a la cepa de control que contiene un vector vacío. Sin embargo en el mismo medio, la levadura de realización AvrE1 muestra un crecimiento ligeramente inferior, probablemente relacionados con algún grado de pérdida del promotor GAL1 y el alto efecto citotóxico de AvrE1. En condiciones de inducción, la expresión de la unidad de efectos AvrE1 causó un fenotipo de inhibición del crecimiento drástico se refleja en la falta de colonias en cualquier dilución. Como ya se observó por Munkvold et al. ^3, la expresión de HopAA1-1 también dio lugar a la inhibición severa de crecimiento, mientras que AvrPto no mostró ningún efecto.

Figura 1. La levadura de inhibición del crecimiento causado por la expresión de la Pseudomonas syringae pv. Tomate (Pst) de tipo III efectores AvrE1 y HopAA1-1. Cepas de levadura (BY4741) que contiene el plásmido pGML10, vacíos o llevar GAL1 impulsada cassettes de expresión inducible por galactosa de AvrPto , HopAA1-1 o AvrE1, se cultivaron durante la noche en medio sintético completo suplementado con glucosa (2%) como fuente de carbono, y carente de leucina. Cultivos fueron lavados, normalizado a OD ₆₀₀ = 1,0 y diluciones seriadas de 10 veces fueron vistos en los medios de comunicación sintética sólida completa falta de leucina y la glucosa que contienen (2%), o la galactosa (2%) y rafinosa (1%). Las fotografías fueron tomadas después de 2 y 3 días de crecimiento a 30 ° C para la levadura crece en glucosa y galactosa los medios de comunicación, respectivamente.

En esta presentación, se muestra cómo utilizar la incipiente levadura Saccharomyces cerevisiae como un sistema heterólogo de expresión de tipo III proteínas efectoras bacterianas y cómo identificar efector fenotipos inducidos por la inhibición del crecimiento. Es importante destacar que estos fenotipos puede ser utilizado en las pantallas de genética para identificar supresores del impacto negativo de los efectores de crecimiento de la levadura. Supresores pueden representar blancos directos de los efectores estudiado o proteínas que participan en los procesos celulares afectados por el efector. Numerosos efectores de tipo III de patógenos de plantas y animales de bacterias se han expresado en la levadura hasta la fecha, y los fenotipos de inhibición del crecimiento causado por varios de ellos fueron utilizados para identificar los procesos o vías que ^1,4 objetivo. En varios estudios, la toxicidad de efectos en la levadura también se aprovechara para identificar nuevos efectores bacteriana ^5. Por otra parte, de efectos inducidos por la inhibición del crecimiento fenotipos pueden ser explotadas para el descubrimiento de fármacos en las pantallas de las bibliotecas químicas de los compuestos que inhiben la toxicidad de los efectores en la levadura de ^6.