Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Hindi was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

आर्गेनाइज़र और Xenopus laevis भ्रूण से पशु ध्रुव Explants और एक कोशिका आसंजन परख की सभा के विच्छेदन

,

Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.224.79.93, User IP: 54.224.79.93, User IP Hex: 920670045

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: आर्गेनाइज़र और Xenopus laevis भ्रूण से पशु ध्रुव Explants और एक कोशिका आसंजन परख की सभा के विच्छेदन

Ogata, S., Cho, K. W. Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay. J. Vis. Exp. (3), e187, doi:10.3791/187 (2007).

Protocol: आर्गेनाइज़र और Xenopus laevis भ्रूण से पशु ध्रुव Explants और एक कोशिका आसंजन परख की सभा के विच्छेदन

तैयारी आसंजन चेम्बर्स (पहले दिन / इंजेक्शन विच्छेदन)

आसंजन परख चेम्बर्स

यदि आप एक पारंपरिक परिसर माइक्रोस्कोप (चरण ऊपर ऑप्टिकल रेखांकित) है, यह ncecessary है बनाने के लिए एक कम ऊंचाई आसंजन चैम्बर के रूप में निम्नानुसार है. खुर्दबीन उल्टे प्रकाशिकी का उपयोग अगर, तो "NUNC लैब टेक संभाग coverglass" बस, प्रयोग किया जा सकता है और # 1 कदम को छोड़ - 2.

  1. एक 40 x 24mm कवर पर्ची पर "प्रेस करने के लिए सील सिलिकॉन विसंवाहक" संलग्न. मजबूती से साफ benchtop कवर पर पर्ची करने के लिए विसंवाहक प्रेस और दूसरी तरफ से देखने के लिए यकीन है कि विसंवाहक किसी भी हवा - बुलबुले के बिना पूरी तरह जुड़ा हुआ है.

  2. वैकल्पिक: वाटमान फिल्टर और सूखी चक्र में कागज आटोक्लेव के साथ एक गिलास पेट्री डिश बाँझ आसंजन कक्षों में रखो . उन्हें आरटी के लिए शांत हो जाओ.

चैंबर कोटिंग

  1. एक autoclaved आसंजन चैम्बर के केंद्र पर (10mg/ml) cadherin या fibronectin (20mg/ml) के समाधान के काम कर रहे हैं, sigmacoated पीले सुझावों का उपयोग करने के 200ml छोटी बूंद रखो. आरटी में 4 घंटे के लिए सेते हैं.

  2. Cadherin या fibronectin समाधान बाहर ले लो और एक 1.5ml ट्यूब को हस्तांतरण. यह समाधान अगले दो सप्ताह के लिए reused किया जा सकता है.

  3. 1x में एमबीएस एच 4% BSA के 500ml बांटना चैम्बर ब्लॉक. आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.

  4. BSA समाधान Aspirate. 1x एमबीएस - एच के 500ml के साथ चैम्बर दो बार धोएं. दूसरा धोने के बाद, एमबीएस एच के सबसे aspirate (नहीं पूरी तरह से), और एक मोहरबंद कंटेनर में 4 º सी. पर दुकान 3 दिन - यह आसंजन चैम्बर अगले 2 के लिए अच्छा है.

विच्छेदन और पशु कैप Explants की हदबंदी

  1. 0.1x एमबीएस - एच में इंजेक्शन भ्रूण सेते हैं, autoclaved एमबीएस एच 1x से पतला है, के रूप में गैर - autoclaved मध्यम कुछ समय से छोटे रोगाणु कि dissociated जानवर टोपी कोशिकाओं को परेशान कर सकते हैं किया जाता है.

  2. 60mm व्यंजन के साथ 1x बार्थ agarose प्लेटें और सीएमएफ - एमबीएस agarose प्लेटें, कम से कम के रूप में अपने नमूनों की संख्या के रूप में कई. 1x बार्थ प्लेटें autoclaved 1x एमबीएस एच डालो. सीएमएफ - एमबीएस प्लेटों के लिए, सीएमएफ - एमबीएस 10ml डालना.

  3. जब भ्रूण 8.5 मंच बन एक 1x बार्थ थाली में पशु टोपियां विदारक शुरू करते हैं. 10 - नमूने के अनुसार 15 explants आम तौर पर कर रहे हैं एक प्रयोग के लिए पर्याप्त है.

  4. सीएमएफ - एमबीएस थाली करने के लिए पशु टोपी explants स्थानांतरण. के लिए 45 explants सेते - 60 मिनट तक explants पूरी तरह से अलग हैं. हर 15 मिनट में कोमल आंदोलन हदबंदी में मदद मिलेगी.

सेल आसंजन परख

  1. कोशिकाओं सीडिंग: 1x एमबीएस - एच के आसंजन ऊपर वर्गों, आसंजन परख मंडलों और चैंबर कोटिंग में चरणों में तैयार कक्ष 500ml बग़ैर. थाली सीएमएफ - एमबीएस से आसंजन sigmacoated और कटा बंद पीले सुझावों के साथ कक्ष का उपयोग कर P200 dissociated जानवर टोपी कोशिकाओं स्थानांतरण.

  2. वैकल्पिक: यदि संभव हो तो, ध्यान से मध्यम चूसना हवा करने के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में लाने के बिना आधे रास्ते करने के लिए 2 / 3 लगभग . लगभग एक ही राशि के ताजा एमबीएस - एच, लगता है कि मध्यम पर्याप्त 2 Ca शामिल + और ​​2 मिलीग्राम + . जोड़ें

  3. आरटी पर 90 मिनट - 45 के लिए सेते हैं. कोशिकाओं कभी कभी की जाँच के लिए यदि वे नीचे की सतह के लिए संलग्न कर रहे हैं.

  4. अब आप एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की तस्वीर ले जा सकते हैं.

  5. एक ग्रिड स्लाइड गिलास पर आसंजन कक्ष रखो. ग्रिड स्लाइड के एक कोने में एक आसंजन चैम्बर के कोनों संरेखित करें. गणना और कई अलग अलग ग्रिड में संलग्न कोशिकाओं की संख्या में रिकॉर्ड.

  6. एक बड़े प्लास्टिक की बाल्टी (जैसे, Tupperware, आदि) में एमबीएस एच के 1L डालो. धीरे बाल्टी के नीचे आसंजन स्लाइड कक्ष डाल दिया. कक्षीय हिलनेवाला पर यह कम गति (- 60rpm 50) पर पांच मिनट के लिए घुमाएँ.

  7. आसंजन कक्ष ग्रिड स्लाइड पर वापस रखो ग्रिड स्लाइड के समान कोने के कक्ष के एक ही कोने aligning, के रूप में इस अनुभाग में, कोशिका आसंजन परख के कदम # 5 में किया गया था. जो एक ही ग्रिड है कि आप धोने से पहले गिनती है पर संलग्न रहते कोशिकाओं की संख्या गिनो. कि धोने के बाद संलग्न रहते कोशिकाओं का प्रतिशत की गणना.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: आर्गेनाइज़र और Xenopus laevis भ्रूण से पशु ध्रुव Explants और एक कोशिका आसंजन परख की सभा के विच्छेदन

Materials: आर्गेनाइज़र और Xenopus laevis भ्रूण से पशु ध्रुव Explants और एक कोशिका आसंजन परख की सभा के विच्छेदन

Name Type Company Catalog Number Comments
1x MBS-H Buffer Modified Barth’s medium: 1L recipe5.14gNaCl75mgKCl0.2gNaHCO30.2gMgSO47H2O60mgCaCl22H2O80mgCa(NO3)24H2O2.38gHEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS Buffer This is Ca2+/Mg2+-free version of MBS-H. 500ml recipe :2.57gNaCl37.5mgKCl0.1gNaHCO31.19gHEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
1% agarose/1x Barth’s plates as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera Reagent Sigma-Aldrich E-2278 Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in 20C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution Reagent Sigma-Aldrich F-1141 This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H Buffer BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips Tool
No.1 cover slips 40x24mm or 60x24mm
Press-to-seal silicon insulator Tool Glace Bio-Labs JTR20-2.5 2.5mm depth x 20mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass Tool Fisher Scientific 12-565-471 2wells/slides
Grid slide glass Tool or Finder graticule for cell counting

Ask the Author: आर्गेनाइज़र और Xenopus laevis भ्रूण से पशु ध्रुव Explants और एक कोशिका आसंजन परख की सभा के विच्छेदन

1 Comment

* Benefits of streaming video-allows user to demonstrate a variety of techniques/skills
* Possible challenges/problems with using streaming video-problems may be associated with the preparing of the video, setting up, demonstrating and voice recording
* Whether or not you currently use streaming video in your class-I don't use any streaming video at this time
* Whether or not you plan on using streaming video in your hybrid class, and if so, how-I would love to use straming video for demos of skills.
* Any online sources of streaming video with which you are familiar-medscape strams vidoeos periodically which I have incorporated into my lectures.

1

Reply

Posted by: AnonymousMay 24, 2007, 7:44 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter