组织者和动物极植从非洲爪蟾胚胎和装配一个细胞粘附实验的剖析

准备附着力钱伯斯（前一天注射/夹层）

黏附实验房

如果你有一个传统的复合式显微镜（舞台上方的光学定位），它是ncecessary低高度粘连室如下。如果使用倒置光学显微镜，然后“NUNC实验室TEK腔玻璃罩”可以被使用，并跳过步骤＃1 - 2。

1. 附上“压密封的硅绝缘体”40 x 24毫米盖玻片之一。用力按下绝缘体清洁台式盖玻片，从另一个侧面看，以确保该绝缘子是完全没有任何气泡附着。
   
   
2. 可选：将粘附在一个玻璃的Petri盘的Whatman滤纸和干燥周期中的反应釜消毒室。冷却下来到RT。

涂总商会

1. 把200毫升液滴的钙粘蛋白（10mg/ml的）或纤维连接蛋白（20mg/ml）到蒸压粘连室的中心工作的解决方案，使用sigmacoated黄芽。在室温下孵育4小时。
   
   
2. 取出的钙粘蛋白或纤维连接蛋白解决方案，并转移到1.5ml管。未来两个星期内，该解决方案可重复使用。
   
   
3. 免除1X按揭证券 - H 500ml的4％BSA块室。在室温下孵育1小时。
   
   
4. 吸BSA溶液。 500毫升1X MBS - H的清洗室两次。第二次洗涤后，吸出的MBS - H的大部分（不完全），并储存在密封容器内4℃这粘连商会是在未来2 - 3天。

动物第植体解剖和离解

1. 孵育0.1倍MBS - H的注入胚胎，从蒸压1X按揭证券- H的稀释，非蒸压中期的某个时候进行小的细菌，可以扰乱分离的动物上限细胞。
   
   
2. 60毫米菜1X巴特的琼脂糖板和CMF -按揭证券琼脂糖板，至少为样品的数量很多。蒸压1X MBS - H倒入1X巴特的板块。 CMF -按揭证券板块，倒入10毫升CMF -按揭证券。
   
   
3. 当胚胎成为8.5阶段，开始在1X巴特板解剖的动物帽。 10 - 15％的样品植通常就足够了一项实验。
   
   
4. 将动物第植到CMF的按揭证券板块。育植的45 - 60分钟，直到植是完全分离的。在每15分钟的温和鼓动将有助于解离。

细胞粘附实验

1. 播种细胞：分装500毫升1X按揭证券 - H以上的部分，粘附实验分庭和涂料商会的步骤准备粘附室。传输从CMF的按揭证券板块的分离的动物第细胞粘附室使用一个sigmacoated和切碎黄芽P200。
   
   
2. 可选：如果可能的话，小心吸中期约2 / 3中途不暴露在空气中的细胞， 。新增大约相同数量的新鲜MBS - H，以确保中期含有足够的钙^{2 +}和Mg ^{2 +。}
   
   
3. 在室温下孵育45 - 90分钟。偶尔检查细胞，看看他们是否附加的底部表面。
   
   
4. 现在你可以利用细胞在显微镜下的图片。
   
   
5. 把网格载玻片上的附着力室。对齐粘附室的角落之一电网幻灯片的一个角落。点算并记录在几个不同的网格的贴壁细胞数量。
   
   
6. 倒在一个大塑料桶（例如，特百惠等）的MBS - H 1L。轻轻把粘附幻灯片室桶的底部。旋转的轨道摇床在低速（50 - 60rpm）5分钟。
   
   
7. 把粘连室对电网的幻灯片，调整室的角落电网幻灯片相同的角落，在本节中，细胞粘附实验步骤＃5。计数保持在同一电网连接，你有洗涤之前算细胞数目。计算保持后洗去附着的细胞的百分比。