Dissection של ארגונית הקוטב Explants בעלי חיים מעוברים Xenopus laevis והרכבה של Assay הידבקות התא

הכנת לשכות הדבקה (יום לפני ההזרקה / דיסקציה)

Assay הדבקה צ'יימברס

אם יש לך מיקרוסקופ מתחם קונבנציונלי (מאתרת אופטי מעל הבמה), הוא ncecessary לבצע הדבקה נמוכה גובה קאמרית כדלקמן. אם באמצעות מיקרוסקופ הפוך אופטיקה, ואז "NUNC Lab-Tek Coverglass החדרים" יכול להיות בשימוש, לדלג על שלבים 1 - 2.

1. צרף אחד "מבדד עיתונאים חותם סיליקון" על פתק 40 x 24mm לכסות. היטב בעיתונות מבודדת להחליק את מכסה על benchtop נקי להסתכל מהצד השני כדי לוודא כי מבודדת מחוברת לחלוטין, ללא בועות אוויר.
   
   
2. אופציונלי: שים לתאי הידבקות בצלחת פטרי עם נייר זכוכית מסנן Whatman ו החיטוי במחזור יבש לעקר. מגניב אותם עד RT.

ציפוי הקאמרית

1. שים טיפה 200 מ"ל של עבודה פתרון של cadherin (10mg/ml) או פיברונקטין (20mg/ml) על במרכז החדר הידבקות autoclaved, באמצעות טיפים צהוב sigmacoated. לדגור על RT במשך 4 שעות.
   
   
2. קח את הפתרון cadherin או פיברונקטין והעברת צינור 1.5ml. פתרון זה ניתן לעשות שימוש חוזר במשך השבועיים הקרובים.
   
   
3. לוותר 500ml של BSA 4% 1x MBS-H לחסום את החדר. לדגור על RT במשך שעה 1.
   
   
4. לשאוב את הפתרון BSA. שטפו את החדר עם 500ml של 1x MBS-H פעמיים. לאחר לשטוף את השני, ישאפו רוב MBS-H (לא לגמרי), ולאחסן במכל אטום על 4 º C. זה תא הידבקות טובה עבור 2 הבא - 3 ימים.

Dissection ו דיסוציאציה של Explants שווי בעלי חיים

1. דגירה עוברים מוזרק 0.1x MBS-H, בדילול מן 1x autoclaved MBS-H, כלא autoclaved בינוני מתישהו נושאת חיידקים קטן שיכול להפריע כובע התאים ניתק בעלי חיים.
   
   
2. הפוך את agarose 1x בארת' של צלחות CMF-MBS agarose צלחות עם מנות 60mm, לפחות כמספר במספר דגימות שלך. יוצקים autoclaved 1x MBS-H על צלחות 1x של בארת'. עבור CMF-MBS צלחות, לשפוך 10 מ"ל של CMF-MBS.
   
   
3. כאשר עוברים הופכים בשלב 8.5, להתחיל לנתח את המכסים בעלי חיים צלחת בארת' של 1x. 10-15 explants לכל דגימות הן בדרך כלל מספיק עבור ניסוי.
   
   
4. מעבירים את הכובע explants חיה לצלחת CMF-MBS. דגירה explants עבור 45-60 דקות, עד explants הם ניתק לחלוטין. בהסתה עדין בתוך כל 15 דקות יעזור דיסוציאציה.

הדבקה Cell Assay

1. מתזמן את התאים: לוותר 500ml של 1x MBS-H לחדר הדבקה מוכנים של השלבים בסעיפים לעיל, Assay לשכות הדבקה וציפוי הקאמרית. העברת כובע התאים ניתק חיה מהצלחת CMF-MBS לחדר הדבקה באמצעות P200 עם טיפים צהובים sigmacoated ו הקצוצות.
   
   
2. אופציונלי: אם אפשר, בזהירות למצוץ את בינוני עד כ 2 / 3 ל באמצע הדרך, בלי לחשוף את התאים באוויר. מוסיפים בערך אותה כמות של טרי MBS-H, כדי לוודא בינוני מכיל מספיק Ca ^{2 +} ו - Mg ^{2 +.}
   
   
3. לדגור על RT עבור 45-90 דקות. בדוק את התאים מדי פעם כדי לראות אם הם מצרף אל פני השטח התחתון.
   
   
4. עכשיו אתה יכול לקחת את התמונה של התאים תחת מיקרוסקופ.
   
   
5. שים את תא הדבקה על זכוכית שקופית הרשת. יישר באחת הפינות של החדר הידבקות לפינה של השקופית הרשת. הרוזן ולהקליט את מספר התאים המחוברים לרשתות שונות.
   
   
6. יוצקים 1 ליטר של MBS-H בתוך דלי פלסטיק גדול (למשל, פלסטיק וכו '). בעדינות את תא שקופיות הידבקות לתחתית הדלי. סובב אותו על שייקר מסלולית במשך חמש דקות במהירות נמוכה (50 - 60rpm).
   
   
7. שים את תא הידבקות בחזרה בשקופית רשת, יישור מאותה פינה של החדר לפינה אותו להחליק את הרשת, כפי שנעשה בשלב 5 של זה Assay, סעיף Cell הדבקה. ספירת התאים שנותרו מחוברים על הרשת באותו שיש לך לספור לפני הכביסה. חישוב אחוזי התאים נשארים צמודים לאחר הכביסה.