Tillämpning av Stoppad-flöde Kinetics metoder för att undersöka verkningsmekanismen av en DNA Repair Protein

A. Mätning av MSH2-Msh6 DNA-bindande Kinetics

1. Provberedning för MSH2-Msh6 DNA-bindande kinetik experiment

Beredning av reagenser för en fluorescens-baserad kinetiska DNA-bindande experiment på ett stoppat-flöde liknar den för en jämvikt experiment på ett fluorometer. Faktum jämvikt bindande analys bör utföras först uppskatta dissociationskonstanten (K _D) för samverkan i syfte att optimera reaktionen förutsättningar för kinetisk analys. Stoppad-flöde experiment kräver större mängder av biologiskt material jämfört med jämvikt eller steady-state experiment, och därför är den metod mest genomförbara när låg milligram mängder protein finns ^11,12 och liknande mängder av ligander kan förberedas eller köpas.

1. Vi över-express S. cerevisiae MSH2-Msh6 i E. coli och rena milligram mängder av proteinet genom jonbyteskromotografi (Fig. 1) ^11.
2. DNA-reagenser med eller utan 2-Aminopurine fluoroforen kan kemiskt syntetiserade. Vi köper 37 nukleotid längd enkelsträngat DNA modifierad med 2-Aminopurine och glödga två kompletterande delar för att förbereda duplex DNA med 2-Aminopurine anslutning till ett G: T mismatch (Fig. 2). DNA kan renas av tillverkaren eller i laboratorium med denaturering elektrofores polyakrylamidgel, den senare i allmänhet ger högre avkastning.
3. För DNA-bindande kinetik förbereds separata G: T (2-Ap) DNA och MSH2-Msh6 prov protein i DNA-bindande buffert (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mm MgCl _2, 100 mM NaCl). MSH2-Msh6 och koncentrationer DNA 0,8 mikroM och 0,12 mikroM respektive, vilket ger 0,4 ìm och 0,06 mikroM slutliga koncentrationer i en enda blandning experimentera med 1:01 blandningsförhållande. För DNA-dissociation kinetik, förbereda ett prov som innehåller 0,8 mikroM MSH2-Msh6 och 0,12 mikroM G: T (2-Ap) DNA, och ett annat prov med 8 mikroM omärkta G: T-DNA som en fälla för fri MSH2-Msh6. Förbered och lagra proverna på is. I dessa reaktioner är proteinkoncentration väl över 10 nm K _D för MSH2-Msh6-DNA-interaktion och DNA-koncentrationen är tillräckligt för en robust fluorescenssignalen (bestäms empiriskt). En volym av 400 l per prov räcker för att få ca 10 kinetisk spår (tabell 1).
4. Använd hög kvalitet kemikalier som är fria från fluorescerande föroreningar i protein, DNA, och förberedelser buffert. Filtrera alla buffertar genom ett 0,2 ìm membran för att undvika igensättning stoppad-flöde med partiklar.
5. Om fluoroforen absorberar synligt ljus, förberedelse och experiment måste utföras under dåliga ljusförhållanden.

2. Instrument förberedelse för MSH2-Msh6 DNA-bindande kinetik

En stoppad-flow instrumentet är mycket enkelt i princip. Den använder en motor för att snabbt trycka två lösningar köra sprutor i en blandning enhet, flyter den blandade lösningen sedan till en observation cell för insamling av data (Fig. 3). Vi använder KinTek slutade-flöde, som kräver låg provvolym, tillåter enkel eller sekventiell blandning av reaktanter, upptäckt av en mängd olika optiska signaler, och är mycket lätt att använda. Stoppad flöde instrument finns tillgängliga från flera andra tillverkare också.

1. För att förbereda de slutade flöde instrument för experiment, se till att datorn och styrenheten är avstängda. Slå på cirkulerande vattenbad ställa till rumstemperatur (25 grader, C) för att kyla lampan. Tänd lampan. Ställ monokromator till önskad excitationsvåglängden (315 nm vid 2-Aminopurine). Vrid springa hjulet till önskad springa bredd (empiriskt balans hög fluoroforen excitation med låg fotoblekning). Slå på styrenheten och datorn. Slå på cirkulerande vattenbad för att fylla vatten jacka som upprätthåller reaktanterna vid en önskad temperatur under försöket (30 ° C i händelse av S. cerevisiae MSH2-Msh6).
2. Därefter kör slutade flöde programmet. Slå på detektorn val, vilket i detta fall är en fotomultiplikatorn rör (PMT) med en inblandning filter lämpliga för fluoroforen (350 nm cut-off-filter vid 2-Aminopurine). Applicera spänning till PMT. Mät mörka gällande att korrigera för eventuella bakgrunden elektriska störningar.
3. Det slutade flöde köra sprutor och observation cell måste tvättas före lastning proverna. Ställ Valve Sample Fylla till lastens läge. Fyll en 1 ml spruta med avjoniserat, filtrerat vatten, bifoga den till lastningshamnen ligger under enheten sprutan, och manuellt tryck vattnet mellan de två sprutorna några gånger. Upprepa processen två gånger för varje enhet sprutan som används i experimentet. Därefter fyller den enhet sprutor med vatten för att tvätta observation cellen. Stäng av Valve Sample Fylla till branden position. Använd Justera spruta Drivekommandot, som kontrollerar motor, och sänk Drivplatta att driva vatten genom observation cellen och in i avsluta linjen. Var noga med att inte trycka kolven ända till slutet av enheten sprutan. Höj enheten plattan. Stäng av ventilen till lastens läge. Manuellt tvätta sprutor med reaktionen buffert och lämna tomt. Instrumentet är nu redo för användning.

3. MSH2-Msh6 DNA-bindande experiment och dataanalys

1. Överför varje prov från röret till en ny 1 ml spruta. Fäst varje prov sprutan en lastningshamnen och tryck lösningen i enheten sprutan. Var noga med att ta bort alla luftbubblor genom att manuellt trycka in lösningen mellan de två sprutor ett par gånger med återkommande pauser. Nedre enheten plattan tills den kommer i kontakt toppen av enheten sprutor. Låt reaktanter jämvikt till rumstemperatur i några minuter.
2. För datainsamling, öppna Set Time / Kanaler fönstret väljer datainsamling kanal (PMT), läge för dataanalys (fluorescens), och antalet spår (bilder) som ska samlas in. Skriv in datainsamlingen tid under vilken 1000 datapunkter kommer att samlas in. En okänd reaktion bör övervakas under flera sekunder för att upptäcka eventuella långsamma faser. Empiriskt uppskatta den tid som krävs för att nå jämvikt eller steady state och data som hämtas är till ≥ 6 halv liv. Vid MSH2-Msh6 den optimala tidsramen är 2 sekunder för G: T mismatch bindande kinetik och 60 sekunder för G: T dissociation kinetik. Nu ställa in ventilen till BRAND position och klicka på Samla in data-knappen. Denna åtgärd initierar blandning av MSH2-Msh6 och DNA, inträde av reaktionen i observationen cellen, excitation av 2-Aminopurine fluoroforen och insamling av den fluorescens signalen över tiden. Samla minst 5 kinetisk spår för att få högkvalitativa data och spara filen.
3. När experimentet är klar, stäng av lampan. Tvätta sprutor och observation cell med vatten enligt tidigare. Stäng sedan resten av utrustningen, utom för cirkulerande vatten bad. Vattnet cirkulerar i ytterligare 15 minuter för att kyla lampan.
4. Matematiska operationer och data montering kan utföras med KinTek själva programvaran, för att få en känsla av reaktionskinetik under experimentet. Ytterligare analyser kan även utföras som genomsnittet av flera kinetiska spår och att spara och exportera genomsnitt filen till andra data analys / grafiska program.

4. Representativa resultat för MSH2-Msh6 DNA-bindande kinetik

Kinetiska data för MSH2-Msh6 interaktioner med G: T obalans DNA, kan passa till en enda exponentiell funktion och ger en snabb bindande hastighetskonstant K _på nära 3 x 10 ⁷ M-1 sekund-1 (Fig. 4A) och en långsam dissociationskonstant k _OFF 0,012 second ^-1 (Fig. 4B), som visar att MSH2-Msh6 binder ett G: T mismatch snabbt och bildar ett mycket stabilt komplex med en halveringstid nära 60 sekunder ^13.

B. Mätning av MSH2-Msh6 ATPas Kinetics

1. Provberedning för MSH2-Msh6 ATPas kinetik experiment

1. Förbered MSH2-Msh6 och DNA reagenser som tidigare beskrivits, med hjälp av omärkta DNA. Dessutom renar Fosfat bindande protein (PBP) från E. coli och märk den med MDCC fluoroforen (bild 5) ^14,15. MDCC-PBP binder fritt fosfat snabbt (K _på motsvarar 1 x 10 ⁸ M ^-1 second ^-1) och med hög affinitet (K _D = 100 nM), vilket resulterar i en dramatisk ökning av MDCC fluorescens (bild 6). MDCC-PBP är därför en robust reporter av pre-steady state ATP hydrolys och fosfat släpper kinetik ^14,15. Observera att det är viktigt att minimera bakgrundsnivåer fosfat för denna analys, och därför bör användning av glas strikt undvikas i alla skeden av REAGENSBEREDNING.
2. Bered ett prov med 4 mikroM MSH2-Msh6 protein med eller utan sex mikroM G: T-DNA, vilket ger 2 mikroM och 3 mikroM slutliga koncentrationer i en enda blandning experimentera med 1:01 blandningsförhållande. Observera att pre-steady state experiment kräver hög enzym koncentrationer eftersom signalen av intresse från en enda omsättning eller de första katalytiska omsättning. Förbered ett annat prov som innehåller 1 mM färska upplöst ATP och 20 mikroM MDCC-PBP reporter. Lägg till 0,10 enheter / ml av purin nukleosidanalog phosphorylase och 200 mikroM 7-methylguanosine vid proverna, som tjänar till att torka upp eventuella kontaminerande fosfat. Inkubera prov på is i minst 20 minuter (tabell 2).

2. Instrument förberedelse för MSH2-Msh6 ATPas kinetik

1. Förbered slutade flöde instrument för experiment som beskrivits tidigare. Dessutom torka upp fosfat föroreningar från enheten sprutor med 0,5 enheter / ml purin nucleoside phosphorylase och 200 mikroM 7-methylguanosine i 20 minuter. Ställ excitationsvåglängden till 425 nm och använda en 450 nm cut-off-filter med PMT för detektion av MDCC-PBP fluorescens.

3. MSH2-Msh6 ATPas experiment och dataanalys

1. Ladda enheten sprutor med de prover som beskrivits ovan. Klicka på Samla in data för att blanda MSH2-Msh6 med ATP och MDCC-PBP och övervaka fosfat släpp av MSH2-Msh6 och den kopplade ökningen MDCC-PBP fluorescens över tiden. Samla minst 5 kinetisk spår för att få en hög kvalitet datauppsättning och spara filen. Genomsnittlig flera kinetiska spår och exportera data fil för analys.
2. Förbered en kalibreringskurva för att bestämma den linjära sambandet mellan fosfat och MDCC-PBP fluorescens. För att göra det, blanda MDCC-PBP med olika fosfat koncentrationer under samma experimentella förhållanden i slutat-flöde, och mäta maximal MDCC-PBP fluorescens vid varje fosfat.
3. Plotta den maximala MDCC-PBP fluorescens kontra varje fosfatkoncentrationen för kalibreringskurvan (bild 7) och använd lutningen för att få fosfatkoncentrationen i MSH2-Msh6 reaktioner. Tomt fosfatkoncentrationen tiden och passar data till en exponentiell och linjär funktion. Denna funktion beskriver en explosion av pre-steady state ATP hydrolys och fosfat släpper följt av linjära steady state fasen av reaktionen.

4. Representativa resultat för MSH2-Msh6 ATPas kinetik

Den kinetiska data visar att MSH2-Msh6 hydrolyserar ATP och frigör fosfat snabbt i 1,4 second ^-1 i första katalytiska omsättningen. Denna fas följs av en långsam steg i reaktionen som begränsar efterföljande omsättning till en 7-faldig långsammare steady state k _katt på 0,2 sekunder ^-1 (Fig. 8A). Men är då MSH2-Msh6 är bunden till omaka DNA, brast av ATP hydrolys och fosfat frigöra undertryckta och MSH2-Msh6 kvar i en ATP-bundet under en längre tid.

Figur 1. Rening av S. cerevisiae MSH2-Msh6 från E. coli. MSH2 och Msh6 gener har klonat in pET11a vektor och överrepresenterade i E. coli BL21 (DE3) celler. Den proteinkomplex renades genom kolonnkromatografi över SP-sepharose, heparin, och Q-sepharose hartser. SDS-PAGE analys visas här innehåller protein fraktioner från ett Q-sepharose kolumn.

. Figur 2 Kompletterande enkelsträngat DNA glödgas för att bilda en dubbelsidig innehåller G: T obalans med ett intilliggande Adenosin (för ATPas experiment) eller 2-Aminopurine fluorescerande bas analog av adenosin (för DNA-bindande experiment).

Figur 3. Flöde av reaktanter i KinTek slutade-flow under en enda blandning experiment.

Figur 4a kinetik MSH2-Msh6 interaktion med ett G:. T obalans. Blandning av duplex-DNA (0,12 M) som innehåller en G: T i anslutning till 2-Aminopurine med MSH2-Msh6 (0,8 M) leder till ökning av fluorescens över tiden och ger en bimolecular hastighetskonstant K på = 2,4 10 ⁷ m ^-1 s ^-1 för interaktionen.

Figur 4b kinetik MSH2-Msh6 interaktion med ett G:. T obalans. Blandning förformade MSH2-Msh6 G: T (2-Ap) komplex med överskott omärkta G: T-DNA (8 M) som fångar några gratis MSH2-Msh6 leder till en minskning av fluorescens över tiden och ger en långsam dissociation hastighetskonstant, k OFF = 0,012 s ^-1, vilket indikerar ett stabilt komplex med en lång halveringstid på ~ 60 sekunder. Slutliga koncentrationer: 0,4 mikroM MSH2-Msh6, 0,06 mikroM märkt DNA, 4 mikroM utan etikett G: T-DNA fälla.

Figur 5. MDCC-PBP beredning. SDS-PAGE analys av E. coli fosfat bindande protein (PBP), renat och märkta med MDCC fluoroforen.

Figur 6. MDCC-PBP svar på fosfat. Titrering av MDCC-PBP med fosfat (Pi) resulterar i ökad MDCC fluorescens.

Figur 7a. Förberedelse av fosfat (Pi) standardkurvan. MDCC-PBP (20 M) blandas med olika mängder Pi (0-8 M) end fluorescensen mäts över tid tills jämvikt har uppnåtts. Slutliga koncentrationer: 10 mikroM MDCC-PBP, 0 till 4 mikroM Pi.

Figur 7b. Förberedelse av fosfat (Pi) standardkurvan. Maximal MDCC-PBP fluorescens är ritas [Pi] för att ge en standardkurva. Lutningen på linjen (0,383 mikroM ^-1 i detta fall) används för att omvandla MDCC-PBP fluorescens i Pi koncentration.

Figur 8a. MSH2-Msh6 ATPas kinetik. MSH2-Msh6 (4 M), i avsaknad G: T-DNA, blandas snabbt med ATP (1 mm) och MDCC-PBP (20 M) uppvisar en explosion av ATP hydrolys och Pi release. Dataanalys ger den hastighet (k _hydrolys = 1,4 s ^-1) och amplitud (2 mikroM, 1 plats per MSH2-Msh6) av brast fasen, som följs av en linjär, steady state fas med en hastighet av 0,4 mikroM s ^{- 1} (k _cat = 0,2 s ^-1).

Figur 8b. MSH2-Msh6 ATPas kinetik. Tillägg av G: T-DNA till en reaktion (6 M) undertrycker brast av ATP hydrolys, stabilisera den komplexa i en ATP-bundet tillstånd. Slutliga koncentrationer: 2 mikroM MSH2-Msh6, 500 mikroM ATP, 3 mikroM DNA, 10 mikroM MDCC-PBP. Burst kinetik är lämpliga med följande ekvation: [Pi] = A ₀ ^{E-k t} + Vt, där [Pi] är fosfatkoncentrationen A ₀ är den brast amplituden, k är den observerade sprack hastighetskonstant och V är hastigheten den linjära fasen (k _cat = V / [MSH2-Msh6]).

Tabell 1 DNA-bindande reaktion

Tabell 2 ATPas reaktion

Exemplet med en DNA mismatch protein som beskrivs här illustrerar kraften och nyttan av övergående kinetiska metoder för att studera de mekanismer av biologiska molekyler. Stoppad-flödesmätning om den gemensamma omsättningen tidsskalan som entydiga bevis för snabb och specifik bindning av MSH2-Msh6 protein till ett omaka baspar och bildandet av ett långlivat protein X DNA-komplex i reaktionen ^9. Dessutom tillhandahålls slutade-flöde (och släcka-flöde) analys av ATPas aktivitet direkta bevis för MSH2-Msh6 byta till en ATP-bundna konformation efter bindande stämmer DNA ^11,16. Denna switch är en hypotes att signalera DNA-reparation ^17,18. Sådana högupplösta kinetiska data, tillsammans med kompletterande högupplösande strukturella uppgifter är nödvändiga för att främja förståelsen av makromolekylära funktion.