Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

Chapeamento de células CHO-K1:

1. Adicionar 50-100μl de células CHO-K1 que foram tripsinizados de acordo com protocolos padrão de 6ml de completo F-12K.
2. Mix suspensão celular por pipetagem cima e para baixo várias vezes, então alíquota 300 ml de suspensão de células tripsinizados a cada poço de uma câmara estéril 8-Lab-Tek II Chambered lamínula com # 1.5 borosilicato lamela câmaras (Nalgene Nunc Int;. Produto # 155409; Lote: 100808-8-0).
3. Incubar as amostras a 37 ° C CO, 5% ₂ durante a noite.

Transfecção transiente de células CHO-K1 com pSNAP-ADRB2 e pSNAP-H2B:

1. Verifique as câmaras de cultura de células semeadas no dia anterior para procurar densidade celular e da saúde.
2. Rótulo o número apropriado de tubos de microcentrífuga.
3. Em uma capela de fluxo laminar, configurar misturas complexas transfecção acordo com a tabela de exemplo a seguir, usando 0,3 mg pSNAP-ADBR2 DNA Controle Plasmid ou 0,3 mg de pSNAP-H2B DNA Controle Plasmid, 1 ml de D2 TransPass e 1 ml de TransPass V por reação.

   plasmídeo	número de reações	l de soro livre de médio	mL de D2 TransPass	mL de TransPass V	mL de DNA plasmídeo	mL de D2/reaction TransPass	mL de TransPass V / reação	ng de DNA / reação	DNA conc. (Ng / mL)	mL de DNA plasmídeo / reação
   SNAP-ADRb2	5	236,5	5	5	3,5	1	1	300	472,34	0,7
   H2B SNAP-	5	237	5	5	3	1	1	300	515,89	0,6
   Simulado	5	240	5	5	0	1	1	0	0	0
   Untransfected	5	250	0	0	0	0	0	0	0	0

4. Primeiro, misture o soro livre F-12K com o DNA adequado plasmídeo, em seguida, adicione o reagente TransPass Transfection D2, em seguida, adicionar o reagente TransPass Transfection V. Misture bem os componentes pipetando cima e para baixo suavemente várias vezes após a adição de cada reagente.
5. Incubar a reação em temperatura ambiente por 30 minutos.
6. Durante a incubação, lavar as células uma vez com 600 mL de meio DMEM completo e adicionar 450 mL de meio DMEM completo para cada amostra.
7. Adicionar 50 ul da mistura de transfecção complexo para cada amostra, lentamente e de forma gota a gota.
8. Incubar as amostras durante a noite a 37 ° C, 5% CO _2.

SNAP-Cell Labeling Estrela TMR de células CHO-K1 transitoriamente transfectadas com pSNAP-ADRB2 e pSNAP-H2B:

1. Remova cuidadosamente os meios de comunicação transfecção complexas a partir de cada amostra por sucção a vácuo. Lave as células duas vezes com 600 mL de completo F-12K e substituir a mídia em cada poço com 600 mL de completo F-12K.
2. Mix de mídia rotulagem dye, adicionando 995 mL de completo F-12K e 51 mL 0,6 mM SNAP-Cell substrato TMR-Star. A concentração final da SNAP-Cell TMR-Estrela deve ser de 3mm. Pipeta cima e para baixo várias vezes para misturar após a adição de substrato.
3. Remova cuidadosamente meios de crescimento a partir de amostras e adicionar 200 mL de mídia rotulagem corante a cada poço. Incubar as amostras a 37 ° C, 5% CO ₂ por 30 minutos.
4. Enquanto as amostras são incubação, preparar solução Hoechst 33342 para a coloração nuclear das amostras através da mistura de 1 ml de Hoechst 33342, trihydrochloride, tri-hidratado (10 mg / ml solução em água, 16,2 mM solução; Sondas Invitrogen Molecular) em 10 ml de completo F-12K .
5. Remova a mídia de todas as amostras e adicionar 600 mL da solução de Hoechst diluir para cada amostra. Incubar as amostras a 37 ° C, 5% CO ₂ por 5 minutos.
6. Lavar três vezes com amostras de 600 mL de completo F-12K.
7. Incubar as amostras a 37 ° C, 5% CO ₂ por mais 30 minutos para permitir que fluoróforo unincorporated difundir para fora das células.
8. Após 30 minutos, altere os meios de comunicação nas amostras SNAP-Cell, uma última vez e vá para a imagem.
9. Imagem as células usando um microscópio Zeiss ApoTome Axiovert 200M fluorescente.

Resultados representante

Figura 1. Aqui estãoalguns resultados representativos das imagens fluorescentes por microscopia de fluorescência padrão de viver COS-7 células que estão expressando tag SNAP-fusões. Esta primeira imagem mostra ao vivo COS-7 células que expressam pSNAP-H2B (nuclear histona) marcada com SNAP-Cell TMR-Star. A construção pSNAP-H2B foi gerada usando o tag pSNAP-vetor (m). As células foram marcadas com SNAP-Cell TMR-Estrela por 30 minutos e contrastado com Hoechst 33342 (azul) para núcleos. A fluorescência rosa demonstra a sobreposição da fluorescência vermelha onde a proteína histona está presente, além da fluorescência azul indicando o núcleo. A expressão da proteína H2B é clara e facilmente identificados.

Figuras 2 e 3. Essas duas imagens seguintes mostram ao vivo COS-7 transfectadas transitoriamente com células-pSNAP ADRβ2.
As células foram marcadas com SNAP-Cell TMR-Star (vermelho) e contrastado com Hoechst 33342 (azul). A construção pSNAP-ADRβ2 foi gerada usando o tag pSNAP-vetor (m). As células foram marcadas com SNAP-Cell TMR-Estrela por 30 minutos e contrastado com Hoechst 33342 (azul) para núcleos. A fluorescência vermelha indica a presença de superfície celular ADRB2 proteína receptora de fluorescência azul, enquanto identifica o núcleo.

Há diversas variáveis ​​que afetam os resultados observados, tais como foco intensidade do laser, a capacidade de equipamentos, lentes usadas, etc A fotoestabilidade do fluoróforo determina a rapidez com que a fluorescência deve ser capturado antes de desaparecer.

Este método de rotulagem proteína é versátil e adequada para muitas aplicações. SNAP-tag e CLIP tag tecnologias para a rotulagem específica de proteínas de fusão com sondas sintéticas permitem vários aspectos da função da proteína, incluindo uma variedade de processos dinâmicos em células vivas e em lisados ​​celulares. SNAP, CLIP, MCP e ACP-tag tecnologias oferecem versatilidade e simplicidade extraordinária para a imagem de proteínas em células vivas e fixos e para o estudo das proteínas in vitro. A criação de uma construção de um único gene produz uma proteína de fusão com a tag capaz de formar uma ligação covalente a uma variedade de grupos funcionais, incluindo fluoróforos, biotina, ou grânulos. A proteína de interesse devem ser clonados e expressos apenas uma vez e, em seguida, a fusão pode ser usado com uma variedade de substratos fluorescentes para diversas aplicações a jusante como a rotulagem de proteína simultânea no interior das células vivas, localização de proteínas e translocação, pulse-chase experimentos, estudos de internalização do receptor , rotulagem superfície seletiva de células, proteínas puxar para baixo os ensaios, a detecção de proteínas em SDS-PAGE, citometria de fluxo, de alto rendimento ensaios de ligação em placas de microtitulação, as experiências de interação biosensor, e FRET baseado em ensaios de ligação.

Os autores são empregados por New England Biolabs, que produz os reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Kai Johnsson
Ivan Correa
Andreas Brecht
Katrin Müentener
Chris Noren
Luo dom
Ming Xu
Theodore Davis
Salvatore Russello
Aihua Zhang
Inca Ghosh
Elissa Maunus
Nicholas Labarthe
James MacFarland
John Buswell
Brenda Desmond
James Ellard
Don Comb

1. Johnsson, K. Visualizing biochemical activities in living cells. Nat Chem Biol, 5, 63-65 (2009).
2. Johnsson, K. SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function. NEB Expressions, 3.3, 1-3 (2008).

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