有丝分裂的siRNA转染后的时间推移成像

Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection. J. Vis. Exp. (40), e1878, doi:10.3791/1878 (2010).

siRNA转染和细胞制备

1. 准备加入的纤维连接蛋白（10μg/mL）0.5ML，以及每个将用于4以及LabTek II腔玻璃罩。孵育10-15分钟室温。
2. 根据制造商的指示，准备反向转染的siRNA /脂质体RNAiMAX（Invitrogen）的配合。使用推荐量为每室24道菜要使用（100μL总）。一个类似的产品/转染的协议可以被替换。
3. 取出从腔玻璃罩井中的纤维连接蛋白。以及每个将用于添加的siRNA /脂质体RNAiMAX的复合物100μL。
4. 分装20000组蛋白H2B - mCherry表达细胞，每孔含转染混合物（500μL）。
5. 允许细胞孵化前转染混合物取代常规的细胞培养液1毫升〜24小时。
6. 孵育细胞图像采集前24小时（转染后48小时内）。

显微镜设置和图像采集

7. 图像采集设置有三个主要部分：1）一个细胞的孵化器，适合在显微镜舞台上和潮湿的环境中保持恒定的37℃，5％的CO _2; 2）倒置显微镜配备有一个自动化的阶段，自动荧光和明帘，自动滤光轮; 3）软件包，集成和控制的阶段，百叶窗，和滤光轮。在我们的成像设置，我们使用一个定制OKO实验室细胞培养箱LabTek二腔玻璃罩可以使用。控制的阶段，百叶窗，滤光轮MetaMorph软件提示：OKO实验室阶段顶部的孵化器系统包括了各种不同的盘，碟，或盖玻片大小的适配器。
8. 位置LabTek第二腔玻璃罩在孵化器打开盖子的预热和平衡的孵化器，适配器放置在墓室玻璃罩，并在与橡皮泥的地方举行。所以留在腔玻璃罩盖细胞培养液中不会干出来的。盖上盖子，整个孵化器和显微镜舞台上的地位，确保孵化器是牢固地举行。
9. 使用Metamorph，成立了自己的实验，在软件的菜单栏选择“应用程序/多维收购”。这将弹出一个窗口，在其中你可以选择的频率和长度的timelapse的，每种颜色的曝光时间（如果做多个设置），数量和舞台位置的位置，和Z -节数（如需要的话）。选择在哪里保存数据文件提示的功能，如果使用其他软件比Metamorph，可能会略有不同，但整体的概念是相同的。事无巨细，一个开源的基于ImageJ收购与大多数硬件设置兼容的软件，是一个很好的替代。
10. 对于本议定书的目的，我们将在两个波长（明和mCherry）为8小时，在15级职位提示每15分钟获取图像：如果需要更好的时间分辨率，那么你可以收购之间的时间间隔缩短，但，较少的阶段职位，可以使用，从而较少的有丝分裂细胞将可用于分析。 时，考虑的时间间隔要考虑到过滤器轮之间切换过滤器设置所需的时间，这一点很重要 。
11. 确定最佳曝光时间为每个波长的第一重点领域的使用明照明细胞。在软件中，调整自动对焦功能的唯一的明通道（这将允许该软件在每次收购之前，每个阶段的位置进行自动对焦） 提示：我们用一个40X干相衬的目标，给出色的分辨率没有对石油的需求。视光学所需的分辨率，可用于其他目标 。
12. 切换到mCherry波长和捕捉图像，使用50毫秒的曝光。调整的曝光时间，看到了良好的形象所需的最低。关键是要限制的光的照射，以确保持续的细胞活力量。作为一般规则，这最能实现一个中性密度滤光镜（减少激发光通量）和一个较长的相机的曝光时间，而不是通过增加光照强度。重复此过程要使用的任何额外的波长提示：要确定一个长期的细胞活力为您的实验给予曝光，你可以预览图像所需timelapse的总人数，一个细胞可以生存，暂时调整时间点间距从几分钟到秒（即10分钟变成10秒）。如果你的细胞存活100-200风险（或适当数量），那么您的曝光罚款。如果不是，减少您的激发光，曝光时间，或总数的图像模拟您完整的实验。
13. 下一步，选择和适当数量标志着一个阶段岗位，让您可以实现细胞的人口有足够的采样。 Metamorph将记录的位置，将返回每个收购提示：一般，我试图找到岗位，其中有大量的细胞图像，但是没有那么多，他们过于密集 。 此外，重要的是选择足够的位置，所以，你将有一个很好的机会观察，通过有丝分裂进展的细胞大量。
14. 毕竟timelapse，波长的曝光时间，和舞台上的地位的信息已被记录，选择“预览”屏幕上的按钮，以确定是否该软件是适当控制设备。
15. 一旦你感到满意，选择“获取”按钮在屏幕上进行收购。然后坐下来暗示 ，使计算机和显微镜做的工作：通过观察至少有一个收购的丰满圆润的自动化，以确保一切正常工作 。

图像处理和分析

16. 收购完成后，下一步就是转移到一个形式，是比较容易处理的图像数据。对于本议定书的目的，我将展示如何使用Metamorph电影，那么如何使用ImageJ程序生成图像的蒙太奇。两种格式将被用于量化的目的。
17. 第一步是审查数据。要做到这一点，选择菜单栏中的“应用程序/审查多维数据”。选择文件的位置，然后选择“查看”。这将允许你从每个舞台上的地位的图像的堆栈单独审查。选择所需的舞台上的地位，然后选择“载入图像”。您将能提前通过数据帧帧。
18. 对于那些阶段职位中，细胞通过有丝分裂（DNA和细胞形态确定），您可以使电影的蒙太奇使用Metamorph，或与其他程序，如ImageJ（通过美国国立卫生研究院免费提供）。
19. 要在Metamorph电影中，选择“过程/保存电影”，在菜单栏中。您将可以选择使用帧的速度，和文件类型的电影。然后选择“保存电影”。
20. 为了使蒙太奇，我。STK文件保存为图像的堆栈，它可以用于其他程序，如ImageJ。
21. 在ImageJ打开该文件，并提前帧，直到找到一个细胞通过有丝分裂。作物的面积和周围的细胞选择“图像/重复” 提示：确保所有帧重复。
22. 为了蒙太奇，选择“图像/垛/蒙太奇”在菜单栏中。在这里您可以指定您要包括，蒙太奇的大小和形状的帧，以及是否要帧之间的边界。选择这些热播的“好”。 。保存为TIF文件的蒙太奇，并做进一步处理ImageJ或Adobe Photoshop中的任何提示：更改Metamorph使用更方便的图像处理，以8位格式的 16位格式的文件蒙太奇。
23. 要计算出在不同阶段的有丝分裂的时间，确定T = 0（DNA凝结或细胞四舍五入的第一个迹象），计数染色体在赤道（在前期/前中期的时间），帧帧的数量，直到对齐，直到染色体开始隔离（在中期的时间），帧，直到细胞开始变平（后期/末期/胞质）。在每个有丝分裂阶段的计算时间取决于每帧之间的时间间隔。

代表性的成果

图1说明了一个典型的对照siRNA转染实验中使用的HeLa细胞系表达组蛋白H2B - mCherry结果。这种方法已被用来有效地量化的有丝分裂的时机，揭示了一个意想不到的作用nucleoporin Nup153在有丝分裂¹月底的时间。请点击这里看到图1的放大版本。

在成像和荧光蛋白技术的最新进展，实时成像已经成为常规的细胞分析²方面。一个各种绿色荧光蛋白（和其他颜色的^变种3）标签蛋白被广泛使用或相对容易构造的，可以用来追踪一个细胞分裂的标志，包括DNA / ^{染色体的动态4，5，}中心体复制，细胞周期蛋白B动态^7，核信封细分和重组^8，9，10有丝分裂纺锤体的形成， ^胞质 11的各个阶段。标签蛋白，可单独或联合使用时的激发/发射光谱，荧光标记是兼容的，允许特定事件之间的协调，以进行评估。如果更大的空间和/或时间分辨率/所需，是否可以使用激光扫描，旋转盘，或共振扫描共聚焦显微镜，并与日益增加的分辨率复杂的显微镜选项列表中继续增长。在哺乳动物细胞的有丝分裂的实时成像也已适应在高通量的^RNAi和小分子屏幕12-14使用。因此，一个S最初的实验中，使用这种技术，而可能是相对简单的，这一战略的基础上的可能性是多方面的。

这项工作是由美国癌症协会（PF - 07 - 103 - 01 - CSM），美国国立卫生研究院（R01 GM61275和P30 CA042014），白血病和淋巴瘤协会，Huntsman癌症基金会的支持。

1. Mackay, D.R., Elgort, S.W. & Ullman, K.S. The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis. Mol Biol Cell 20, 1652-1660 (2009).
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