Preparazione di oligomeriche β-amiloide _1-42 E induzione di Impairment plasticità sinaptica in fettine di ippocampo

Risospendere peptide β-amiloide

Prima di iniziare sono pronti:

• Aβ _1-42 (polvere liofilizzata)
• 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP)
• Low-binding tubi in polipropilene microcentrifuga (1,5 ml)
• Hamilton siringa a tenuta di gas con stop tuffo Teflon (250 microlitri)
• Dimetilsolfossido (DMSO)

1. Lasciare Aβ liofilizzato _1-42 equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti per evitare la condensa dopo l'apertura del flacone peptide.
2. Sotto la cappa, risospendere peptidi Aβ _1-42 in HFIP ghiacciata per ottenere una soluzione 1 mM e vortex la soluzione per alcuni secondi.
3. Utilizzando una siringa di vetro con tappo a tenuta di gas Hamilton teflon, subito dividere il Aβ _1-42 / HFIP soluzione altrettanto in tre fiale in polipropilene e sigillare le fiale.
4. Le fiale vengono quindi incubate per 2 ore per consentire monomerization Aβ. Quindi, aprire le fiale e concentrare la soluzione Aβ _1-42 / HFIP sotto vuoto usando una centrifuga SpeedVac (800 g, temperatura ambiente) fino a quando un film peptide chiaro si osserva sul fondo dei flaconi. Controllare accuratamente la temperatura all'interno della centrifuga SpeedVac per evitare il degrado peptide (max 25 ° C).
5. Sigillare le fiale e conservare le aliquote a -80 ° C. Pellicola Aβ può essere conservato per 6 mesi.
6. Risospendere un film con l'aggiunta di DMSO per ottenere una concentrazione fino a 5 mm Aβ _1-42. Sonicare a bagnomaria per 10 minuti per garantire la completa risospensione.
7. Questa aliquota 5mM Aβ _1-42 soluzione in fiale in polipropilene. Sigillare tutti i flaconi e conservarli a -20 ° C. Aliquote vanno scongelati solo una volta. Attenzione alla condensa l'acqua all'interno del congelatore. Peptidi in soluzione degrada molto facilmente.

Oligomerizzazione

Prima di iniziare sono pronti:

• Aβ _1-42 / DMSO (5mm)
• Tampone fosfato sterile
• Low-binding tubi in polipropilene microcentrifuga (1,5 ml)
• Low-binding polipropilene provette (50 ml)

1. Diluire il Aβ ottenuto 5mM _1-42 / aliquota DMSO con tampone fosfato sterile (fino a 100 l).
2. Vortex per 30 secondi e poi incubare per 12 ore a 4 ° C

Fetta trattamento dell'ippocampo

Durante il trattamento fettine di ippocampo, è importante per evitare la mancanza di specifiche adesione peptide su bicchieri, superfici tubo per perfusione, e la camera di registrazione. Usare preferibilmente a basso legame tubi e contenitori in polipropilene. Evitare l'uso di oggetti di vetro o di plastica generico-ware. Mezzi di perfusione deve essere siero o albumina-free.

Perfusione Aβ

Prima di iniziare sono pronti:

• Oligomerized Aβ _1-42
• Registrazione del buffer (in mm: 124 NaCl, 4.4 KCl, 1 Na ₂ HPO _4, 25 NaHCO _3, 2 CaCl _{2, 2} MgCl _2, e 10 di glucosio)
• Registrazione elettrofisiologica set-up con camera di interfaccia
• Trasversale fettine di ippocampo incubate in un tampone di registrazione ossigenato per almeno 90 minuti dopo la dissezione (T = 29 ° C; tasso di perfusione costante = 2 ml / minuto)

1. Immediatamente prima l'esperimento, diluire il Aβ oligomerized _1-42 aliquota alla concentrazione di lavoro appropriati (200 nm o superiore) in un tubo in polipropilene con pre-ossigenato buffer di registrazione.
2. Profumato il Aβ _1-42 soluzione per 20 minuti per le fette prima dell'induzione della plasticità sinaptica.

Induzione di plasticità e di follow-up

1. Tipicamente, il modello più diffuso di plasticità sinaptica è la LTP. Essa può essere indotta attraverso la stimolazione tetanica di una sinapsi dato nell'ippocampo. Registriamo risposte campo da sinapsi tra le proiezioni del Shaffer collaterali e neuroni piramidali CA1 nel radiatum strato. Il nostro stimolazione tetanica è costituito da una stimolazione scoppio theta che comprende 3 treni separati da intervalli di 15 secondi. Ogni treno è composto da 10 scatti a 5 Hz dove ogni raffica comporta 5 impulsi a 100 Hz. Applicare la stimolazione tetanica subito dopo la perfusione di Aβ oligomerized è stata completata.
2. Subito dopo la stimolazione tetanica tornare a perfusione con buffer di registrazione normale. Mantenere una velocità costante di perfusione, temperatura della camera di registrazione e la corretta ossigenazione per tutta la durata dell'esperimento.

Risultati rappresentative e possibili problemi

La Aβ oligomerized secondo il protocollo classico di Stine et coll. ^1, genera monomeri Aβ e una varietà di oligomeri di diverse dimensionis (dimero, trimero, ecc) La perfusione di oligomerized Aβ _1-42 porta a LTP diminuita in Aβ trattati con fette rispetto a fette di controllo. Nelle nostre condizioni sperimentali, in cui 3-5 mesi topi vecchi C57BL/6J maschi sono utilizzati, LTP in 200 nM Aβ trattati con fette è in media del 150% dei valori di base a due ore dopo la stimolazione tetanica, mentre a fette di controllo i valori sono LTP in media 200-250% di baseline2. In alcuni casi, il trattamento con Aβ potrebbe non riuscire a ridurre la LTP ippocampale. Diversi errori critici che potrebbero verificarsi comprendono pellicola durante l'asciugatura eccessiva concentrazione di Aβ e oligomerizzazione incompleta. Perfusione Aβ in fettine di ippocampo potrebbe essere un'altra fonte di preoccupazione a causa delle proprietà fisico-chimiche del peptide Aβ in soluzione, che è incline a non specifica adesione alla plastica. Risoluzione dei problemi di queste questioni è discusso di seguito.

Come descritto in precedenza, diversi problemi nella preparazione di Aβ oligomerici può provocare LTP inalterata. Un modo per valutare se il degrado Aβ o la mancanza di oligomerizzazione Aβ potrebbe essersi verificato è quello di valutare la preparazione Aβ con TRIS-Tricine PAGE / analisi Western Blotting e ultracentrifugazione analitica (non descritte in questo protocollo). Quando Western Blotting campioni sono preparati in condizioni non-denaturing/non-reducing, una preparazione di successo dovrebbe generare una firma Western Blotting con bande corrispondenti a differenti monomeri e gli oligomeri ^3. Un problema spesso si verifica è l'instabilità peptide durante la fase di essiccazione del concentratore SpeedVac. In realtà, essiccazione ad alta temperatura porta alla degradazione delle proteine, avvertibile dal colorazione peptide marcato al marrone. Concentrazione della soluzione HFIP deve essere effettuata a temperatura ambiente e monitorati attentamente. Date le varie fasi procedurali che si verificano nel protocollo, gli errori di diluizione può accidentalmente portare a oligomerizzazione scarsa concentrazione o Aβ fuorviante. È interessante notare che la perfusione con concentrazioni inferiori Aβ suggerito si tradurrebbe in un aumento dei valori LTP ^3. Anche in questo caso, la perfusione influisce sul possibile risultato del trattamento Aβ su fette. Infatti, mantenendo una temperatura costante della soluzione bagno nei nostri esperimenti di elettrofisiologia è fondamentale la temperatura è noto a pregiudicare conformazioni Aβ quando risolto in tampone fosfato. Un'altra fonte di preoccupazione è che Aβ oligomeriche possono non espressamente aderire alle superfici in plastica dei contenitori e tubi utilizzati per la preparazione e perfusione riducendo la concentrazione effettiva esposti a fettine di ippocampo. Quindi, è fondamentale utilizzare a basso legame con le proteine ​​in plastica-ware per garantire la preparazione affidabile e perfusione tutto diversi esperimenti. In questo numero, vi proponiamo in plastica polipropilene-ware che ha dimostrato di non influire sul rapporto tra specie diverse Aβ ^4. Vasta letteratura suggerisce che la malattia di Alzheimer nasce come un disturbo sinaptica ^5. E 'probabile che la sottigliezza e la variabilità dei primi sintomi di amnesia, che si verificano in assenza di altri segni clinici di danno cerebrale, sono dovute a cambiamenti discreti in funzione di una singola sinapsi, prodotto almeno in parte, per specie Aβ ( ad esempio Aβ ₄₂ e Aβ ₄₀₎ ^2,6,7,8. La scoperta che un preparato contenente Aβ sintetico oligomerized _1-42 possono compromettere la LTP ⁹ in vitro ha portato a numerose indagini sui meccanismi della disfunzione sinaptica indotta da un innalzamento Aβ nel cervello. Usando questo protocollo, si descrive una procedura per la preparazione di Aβ oligomerici che ostacola con successo LTP al collaterale strato di collegamento Shaffer radiatum in fettine di ippocampo. Questo paradigma sperimentale ha un enorme valore per lo studio dei meccanismi di Aβ-mediata patogenesi nonché alla valutazione dei potenziali farmaci, che possono ridurre la disfunzione sinaptica ^2,10,11.