Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

El protocolo está destinada para el análisis de cadenas de azúcares de las glicoproteínas o total de una glicoproteína de interés específico. El procedimiento es básicamente el mismo en ambos casos con algunas modificaciones como se indica a través del protocolo.

1. Para el etiquetado del metabolismo de N-glicanos ligados uno tiene que usar una cultura subconfluentes de células de mamífero cultivadas durante la noche en una placa de 90 mm para cada muestra (muestras pueden representar diferentes puntos de tiempo o de tratamientos). Este protocolo está optimizado para las células NIH 3T3.
2. Comer a las células de la glucosa por la incubación en 5 ml de recién preparada previamente calentada (37 ° C) de glucosa en un medio libre, se suministra con dializados 10% de FCS y 4 mM piruvato sódico durante 5-15 minutos.
3. Vuelva a colocar el medio del hambre con 1 ml de pre-calentado (37 ° C) de glucosa en un medio libre con 400 Ci de [2 - ³ H] marcada con manosa (menor concentración de 65 Ci / ml se utiliza para el etiquetado de las glicoproteínas total), e incubar las células en las condiciones de cultivo de tejido normal durante 1 hora.
4. Eliminar el medio de etiquetado de cada muestra, y con cuidado añadir 2 ml de PBS a 4 ° C para las muestras correspondientes a pulso y colocarlos en hielo (estas muestras se denominan pulsos), mientras que las muestras correspondientes a la persecución que ser enjuagados tres veces con 2 ml de pre-calentado (37 ° C) medio normal de cultivo completo, y luego se colocan en una incubadora de CO ₂ a 37 ° C con 5 ml de pre-calentado medio habitual para los períodos de persecución deseado.
5. Enjuague las muestras de pulso (previamente colocado en hielo) 3 veces con 2 ml de helado de PBS. Las células se raspa el plato en 2 ml de PBS utilizando un rascador de células, y se coloca en un tubo Eppendorf de 2 ml.
6. Corto giro de las células a 16000xg (06.10 segundos), descartar el sobrenadante y congelar el sedimento celular a -80 ° C.
7. Siga los pasos 5 y 6 también para las muestras de persecución en el final del tiempo de persecución.
8. Eliminar las células del congelador y lisar ellos por la adición de 300 l de tampón A, vortex brevemente e incubar durante 20 min en hielo, o en el caso del análisis de las glicoproteínas total, por incubación de 20 minutos sobre el hielo con tampón B, seguido por ultrasonidos (4 tiempos, 10 segundos, con un máximo de amplitud), luego hervir las muestras durante 5 minutos.
9. Centrifugar los lisados ​​a 16000xg durante 20 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf y desechar el sedimento.
10. Si el análisis de las glicoproteínas total, proceder a la filtración molecular y deglicosilación (paso 17). Para la inmunoprecipitación de la glicoproteína H2a demostrado aquí, agregar 20l/sample de (Repligen) la proteína A-agarosa 1:01 suspensión y 3 l / muestra de nuestro conejo policlonal de anticuerpos anti H2a para la glicoproteína deseada (en nuestro ejemplo anticuerpos anti-H2a ), el sobrenadante del paso 9.
11. Incubar las muestras de 04.16 horas a 4 ° C, mezclando constantemente por la rotación lenta.
12. De girar las bolas a 16000xg durante 30 segundos y retirar con cuidado el sobrenadante con vacío.
13. Aclarar las cuentas, mediante la adición de 500 l de amortiguación D y agitación. Giro como en el paso 12 y eliminar el sobrenadante. Repita el lavado 3 veces.
14. Añadir 10μl desnaturalización de amortiguación (suministrado con el NEB endo-H kit) a la bolita de cuentas y hervir las muestras durante 5 minutos (cuando las proteínas totales se analizan, el deglicosilación se lleva a cabo en el filtro Microcon, paso 17).
15. De girar las bolas (16000xg durante 30 segundos), y la transferencia del sobrenadante en un nuevo tubo Eppendorf. Luego 0.5μl de endo H enzima se añaden a cada muestra, junto con 10 l de tampón de reacción (también suministrado con el kit NEB endo H), y las muestras se incuban a 37 ° C durante 3 horas.
16. Para separar los glicanos liberados de las proteínas, la muestra se diluye 5 veces con agua destilada y se coloca en la parte superior de un filtro molecular (Microcon Ultracel YM30), con un 30kDa de corte, luego se centrifuga a 14000Xg durante 3 min. Aplicar 50μl de agua destilada y repetir la centrifugación de las muestras. Este lavado se repite 2 veces más, manteniendo el flujo continuo.
17. Si usted está analizando glicoproteínas total, aplicar el sobrenadante de los lisados ​​(desde el paso 9) para el filtro Microcon. Lavar el extracto con 100 l de buffer E, 3 veces por centrifugación repetida en 14000Xg durante 3 min. Añadir 3 l de tampón de reacción 10X endo H y 1,5 l de la enzima endo H al retenido Microcon, y se incuba durante 3 horas a 37 º C. Los glicanos liberados se eluyó con agua desionizada por tres centrifugaciones repetidas, como en el paso 16.
18. Si lo desea, retenidos en los pasos 16 y 17, con endo H resistente a las glicoproteínas son incubados con 200mU de F N-glucosidasa en 15 l de tampón C a 37 ° C durante 16 h. Elución con agua destilada se hace como en el paso 16.
19. Coloque el tubo que contiene la reacción endo H de flujo continuo (medidas 16 y 17) en un concentrador de SpeedVacY secar las muestras por completo (esto se puede hacer hasta 45 ° C para acelerar este proceso).
20. Para preparar las muestras para el HPLC, volver a suspender las bolitas secas en 12 l del solvente HPLC (acetonitrilo: agua, 60:40, 1% de ácido fosfórico).
21. Ajustar el dispositivo HPLC (conectado a la columna Spherisorb) a un flujo constante del disolvente (1 ml / min) y presión (un valor en particular entre 1000 y 2000 psi), y colocar un colector de fracciones para cambiar un tubo de cada 1 minuto.
22. Cargar las muestras en el dispositivo HPLC e iniciar el colector de fracciones de forma simultánea.
23. Recoger 48 fracciones de 1 ml de cada corrida de muestras y de una carrera de una mezcla de oligosacáridos estándar.
24. Transferencia de 500 l de cada fracción a un vial de centelleo, y mezclar el contenido con 3 ml de líquido de centelleo soluble en agua.
25. La carga de los viales y leer en un contador de centelleo.
26. La lectura de la CPM se representa gráficamente como una función del número de fracciones.
27. Los valores de cpm en un pico de representar a una especie específica de glicanos de la siguiente manera: las fracciones 18-21 corresponden a M5, M6 a las fracciones 22-26, 27-31 fracciones de M7, M8 a las fracciones 32-35, 36-39 fracciones de M9, fracciones 40-42 a G1M9 y las fracciones 43-45 a G2M9.
28. La suma de los valores de CPM para las fracciones dentro de cada pico refleja la cantidad absoluta de una especie de glicanos específicos. Con el fin de compensar el hecho de que las especies que contienen más residuos de manosa adquirir más la etiqueta, la "cantidad relativa molar" de cada especie glicano se calcula como sigue: la cantidad absoluta de cada especie glicano se divide por el número de residuos de manosa que contiene . Este valor se divide por la suma de las cantidades molares relativas de todas las especies de glicano obtenidos para obtener el "por ciento del total" para cada especie de glicanos específicos.

Tabla 1. Análisis de la liberación de las cadenas de azúcar en la N-vinculada con deglycosidases y de la presencia de dolichol-oligosacáridos en las muestras de la glicoproteína.

Se aplicó el procedimiento de pulso perseguir a un lisado de células NIH 3T3. Después de la filtración Microcon, denominado N-oligosacáridos fueron puestos en libertad, principalmente con endo H después del pulso de etiquetado (tipo manosa alta) y con un tratamiento adicional con F N-glucosidasa después de un período de persecución, que corresponden al tipo complejo (Golgi procesados ​​glicanos), endo H resistente oligosacáridos. Este análisis cuantitativo determinó que dolichol-oligosacáridos, representaron una fracción insignificante de la etiqueta en el producto retenido inicial.

Notas:

1. Células NIH 3T3 fueron pulso marcado con [2 - ³ H] manosa y persiguió con medio completo. Después de la lisis celular y la filtración a través de Microcon YM30 de alta manosa N-oligosacáridos fueron puestos en libertad de retenidos por la incubación con endo H.
2. Endo H-resistente material retenidos Microcon de (a) se incubó con F N-glucosidasa y puesto en libertad oligosacáridos se mide en un contador de centelleo.
3. Retenidos Microcon obtenido como en (a) antes del tratamiento endo H, se extrajeron cuatro veces con cloroformo: metanol: agua 10:10:03 para eliminar glicolípidos precursor, y el material no extraído disuelve en NaOH 1N y se cuentan en un contador de centelleo.
4. Dolichol-oligosacáridos fueron purificados a partir de extractos de (c) como se describe en 1 y en un contador de centelleo.
5. Promedio de 3 por ciento de los experimentos de dolichol-oligosacáridos (d) del total de cpm en retenido (c + d).

Resultados representante

Figura 1. Pulso-caza análisis del total de las glicoproteínas NIH 3T3 en células no tratadas y la inhibición proteasomal Después de 1 hora de pulso con el etiquetado. [2 - ³ H] se obtuvo un perfil de espera con algunos glucosiladaprecursores restantes (Glc Man ₉ GlcNAc _{2 2} (G2M9) y G1M9), pero la mayor parte de la etiqueta presente en M9 y M8 especies, siendo este último el resultado de la poda de todos los niveles de glucosa y un residuo de manosa (Figura 1 A). No precursores libres pequeña manosa o de otro tipo se han detectado, lo que demuestra la minuciosidad de la purificación. Después de una larga persecución en vez 8h había más extensa de recorte para M7-6 y una pequeña cantidad de M5, pero las principales especies sigue siendo M9 y M8 (Figura 1 B). Si la persecución se hizo en presencia de un inhibidor de la proteasomal (30 M MG-132), sólo había una acumulación de menor importancia de estas mismas especies recortadas (Figura 1 C).

Figura 2. El análisis cuantitativo de las cadenas de azúcar de un sustrato ERAD en comparación con las glicoproteínas total. (A) En un experimento similar a la de la Figura 1, en ​​relación cantidades molares de cada especie de oligosacáridos se calcularon con base en el contenido de manosa. Hemos convertido los valores de cpm obtenidos para cada especie de glicanos, el porcentaje de cada especie en relación con la suma total de las cantidades molares relativas de todas las especies presentes se representó posteriormente en función del tiempo de persecución por un promedio de dos experimentos. (B) similares (A), excepto que glicanos liberados de la ERAD sustrato ASGPR H2a fueron analizadas después de que el etiquetado de pulso y caza de hasta 4 horas, en la presencia o ausencia del inhibidor de la proteasomal MG-132. (C) Los valores de 4 horas de persecución en la presencia de MG-132 de (A) y (B) se comparan para ASGPR H2a y la piscina de la glicoproteína. (D) Esquema de la cadena de azúcar unidos a N procesos de corte en la sala de emergencias. Azúcar recortar los procesos que conducen a la M6-5 ligada a las proteínas (R) que se dirigen a ERAD en comparación con el M9-8 en los que salen al aparato de Golgi y más allá. Los resultados indican que el proceso de ERAD se asocia con la manosa corte de la N-glicanos para producir especies con 5-6 residuos de manosa restantes.

El análisis del pulso-caza de los glicanos en las células vivas con una separación de HPLC proporciona un método para el estudio de la dinámica de los oligosacáridos alteraciones estructurales a lo largo de la vida de una glicoproteína. Hay una creciente evidencia de que tales alteraciones están involucrados en la producción de las señales para doblar ER, control de calidad y sistemas de tráfico ^2-5. El método se puede aplicar no sólo para una glicoproteína de interés específico, sino también para analizar la dinámica de la estructura de las glicoproteínas total, como se ilustra en este artículo, donde se comparó el destino contrastantes de un sustrato ERAD específica y la de la piscina glicoproteína celular . La técnica de purificación es sencillo, pero específicos, sin embargo. Mediante el uso de deglycosidases estricto y filtración molecular se asegura que sólo unidos a N glicanos liberados de las glicoproteínas se obtienen, dejando tras de sí otras macromoléculas marcadas con [2 - ³ H] El hombre, como las cadenas de azúcar en la O-ligado y proteínas GPI-anclado. Oligosacáridos liberados a partir del precursor dolicol son un contaminante insignificante (tabla 1).

El método ofrece una alta sensibilidad de detección utilizando una cantidad muy pequeña de material de partida. Cuando se espera un rendimiento muy bajo, la sensibilidad se puede aumentar mediante la reducción del volumen de las fracciones HPLC utilizando SpeedVac. Por lo tanto, la limitación de la solubilidad de los líquidos de centelleo se puede superar, y todo el contenido de las fracciones pueden ser monitoreados en el contador de centelleo.