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 JoVE Neuroscience

인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

1, 2, 3, 1,4

1Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Neurology, Institute of Clinical Medicine, Tsukuba University, 3Department of Pathology, New York University School of Medicine, 4Department of Neurology, Emory University

Article
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    Summary

    우리는 명확히 인간 대뇌 피질 homogenates, SDS - PAGE로 단백질 분리, 항원 검색 및 Aβ 펩타이드에 대한 항체와 immunoblotting의 준비를위한 기술을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 지속적으로 알츠하이머의 병리 현상과 인간의 대뇌 피질 조직에서 monomeric 및 multimeric Aβ를 감지합니다.

    Date Published: 4/23/2010, Issue 38; doi: 10.3791/1916

    Cite this Article

    Rosen, R. F., Tomidokoro, Y., Ghiso, J. A., Walker, L. C. SDS-PAGE/Immunoblot Detection of Aβ Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval. J. Vis. Exp. (38), e1916, doi:10.3791/1916 (2010).

    Abstract

    β - 아밀로이드의 변칙 접지와 중합도 (Aβ) 펩타이드는 알츠하이머 질병 pathogenesis에 neurodegenerative 층계를 시작 생각됩니다immunoblotting 다음 SDS - polyacrylamide 젤 전기 영동에 의해 감지하실 수 있습니다. 그러나, multimeric Aβ의 분리 및 검출은 고농도 대뇌 피질 homogenates 작은 기공 크기 nitrocellulose의 점막에서 항원 검색의 사용을 필요로합니다. 여기서 우리는 명확히 인간의 대뇌 피질 homogenates의 준비를 위해 기술, SDS - PAGE에 의해 단백질의 분리, 그리고 항원 에피토프 복구 / Aβ 펩타이드의 N - 터미널 지역에 항체 6E10과 모래 바닥 서양을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용, 우리는 지속적으로 알츠하이머의 병리와 인간에서 Aβ 단량체, dimers, trimers, tetramers 및 대뇌 피질의 조직에서 높은 분자량의 multimers을 감지.

    Protocol

    1 부 : 명확히 조직 homogenates의 작성

    1. 약 30도 유봉 스트로크로 (즉, 추가 400μl 버퍼 - 얼음처럼 차가운 버퍼 (플러스 2X 프로 테아제 억제제 칵테일 [산타크루즈] 0.1M 인산 버퍼 호수 [와 MG + + 무료 칼슘 + +])의 4 번 볼륨에서 수정되지 않은 대뇌 피질의 조직을 균질 다운스 100mg 조직).
    2. 3000 5 분 스핀 homogenates g (4 ° C). 조심스럽게 -80에서 명확히 supernatants 이들 추출물의 저장 aliquots를 제거 ° C를 사용까지.
    3. 제조 업체의 지침 (ThermoFisher)에 의하면, bicinchoninic 산성 (BCA) 분석을 사용하여 명확히 homogenates에 대한 총 단백질 농도 (μg / μl)를 결정합니다.

    2 부 : SDS - PAGE 샘플 준비

    1. 물론 10으로 10~20% Tricine 젤 (Invitrogen), 잘마다 로드할 수있는 최대 볼륨 ~ 25μl이다. 총 볼륨 2X SDS 샘플 버퍼와 10X 감소 에이전트를 포함, 잘마다 로드할 수 명확히 homogenate의 최대 볼륨이 10μl가되도록. 20% (W / V) 명확히 피질 homogenates는 당 잘 50μg 총 단백질에 대한 허용, 5 μg / μl 이상의 총 단백질 농도가 있어야합니다. 이하 5mg/ml 단백질과 샘플 당 자 이하 총 단백질을 로딩 할거 것입니다. 그러나, 높은 단백질 수준은 monomeric 및 집계 Aβ의 검색 (50 - 60μg 총 단백질이 최적입니다)에 최적입니다.
      항상마다 잘 총 단백질의 동일한 금액을로드합니다.
    2. 각 젤 들면 SeeBlue Plus2 (Invitrogen)로 분자량 마커의 10μl와 적어도 하나를로드합니다. 긍정적인 제어로, 합성 Aβ40 또는 다른 우물에 Aβ42 펩타이드 (1xPBS에 희석) 10 - 100ng 실행합니다.
    3. 갓 해동, 명확히 homogenates을 사용하여 얼음에서 반응 혼합물을 준비합니다. 5-10초에 대한 소용돌이 튜브, 100에서 건조 욕조에 열을 ° C 5 분 후, 신속하게 모자의 결로를 제거하는 모든 샘플을 스핀.

    파트 3 : SDS - PAGE 젤 전기 영동

    1. , 제조 업체의 지침 (Invitrogen)에 따라, Tricine SDS 실행 버퍼를 사용하여 XCell 물론 잠금 미니 셀 Gelbox에 10~20%의 Tricine 젤로 vortexed 샘플을로드
    2. 약 90 분 동안 125V의 일정한 전압에서 젤을 실행합니다. 4KDa 마커 밴드가 젤의 바닥에서 1cm에 대한 때까지 샘플을 실행하자.

    4 부 : 젤에서 세포막으로 전송 단백질

    1. 조심스럽게 제조 업체의 지침 (Invitrogen)에 따라, 플라스틱 케이스에서 젤류를 제거하고 XCell II 얼룩 모듈 내부 전송 샌드위치를​​ 조립. 사전 서부 유럽 표준시 트리스 - 글리신 전송 버퍼 (20 % 메탄올)과 패드와 0.2μm nitrocellulose 막을 모래 바닥, 그리고 모래 바닥 패드 또는 여과지 / 멤브레인 샌드위치에서 모든 거품을 제거하십시오.
    2. XCell Gelbox에서 전송 버퍼와 내부 챔버를 기입 dIH 2 O (메탄올의 노출 시간이 지남에 따라 플라스틱 gelbox을 입을 수)와 외부 챔버를 입력합니다.
    3. 25mA의 일정한 암페어에서 2~3시간에 대한 전송을 실행합니다.
    4. 전송이 완료되면, 샌드위치를 ​​재조 두 사각형 플라스틱 배양 접시에 1xPBS (또는 다른 적절한 컨테이너)에 dIH 2 O와 점막에 젤 넣습니다.
    5. 단백질 전송의 효율성을 시각화하기 위해, 젤 단순히 블루 SafeStain (Invitrogen) 물들일 수 있으며, 개양귀비빛의 S 붉은 얼룩 (시그마 알드리치)와 안정, 두 제조 업체의 지시에 따라. 이 얼룩은 immunoblotting 영향을주지 않습니다. 얼룩은 비효율적인 단백질 전송을 공개하는 경우 3 단계에서 전송 시간을 수정합니다.

    제 5 부. 항원 - 에피토프 복구 및 Immunoblotting

    1. 항원 검색은 immunoblotting 동안 항체 바인딩을위한 멤브레인에 Aβ epitopes을 드러내는에서 중요한 단계입니다. 100 일정한 온도를 유지 ° 모든 증기선, 전자렌지, 또는 물이 욕조가 C는 충분합니다. 기선의 항원 검색을 위해, 상온에서, 1xPBS 가득한 강력 Kapak 플라스틱 주머니에서 막을 열 - 인감. 미리 온수 기선의 평면 주머니 라이, 파우치는 추가로 15 분 동안 품어, 확장하기 시작 한때. 멤브레인가 과도하게 주름을 방지하기 위해, 주머니에서 제거하기 전에 천천히 냉각 수 있습니다.
    2. 상온에서, 신중하게 피어오르는 주머니에서 멤브레인를 제거하고 5 분 (0.05 % 트윈 - 20과 함께 살린, 산도 8.0을 트리스 버퍼 TBS - T에 린스 다음 1xPBS 5 분 동안 멤브레인을 린스 [시그마] ), 궤도 흔드는에. 떨고 한 시간 동안 차단 솔루션에 멤브레인 (TBS - T에서 2.5 %의 무지방 우유)를 품어. rinsing없이, 피하 풍선 (1:1,000 [1μg/ml] 1:5,000 [0.2μg/ml] 희석, Covance에서 6E10) 차단 솔루션에 희석 기본 항체를 포함하는 음식 또는 플라스틱 주머니에 막를 전송S. 4 떨고 ° C (더 이상 부화 더 나은 신호를 줄 수 있습니다.) 1 시간 후 24~48시간에 대한 실온에서 궤도 흔드는에 품어
    3. TBS - T 30 분 동안 막을 린스 (한 빠른 3 X 10 분 rinses 다음 린스).
    4. 상온에서 흔드는에서 90 분간 차단 솔루션 1:10,000에서 희석 HRP - 복합 이차 항체에 멤브레인 (애머스햄 ECL 양 안티 - 마우스, GE 헬스케어)을, 알을 품다.
    5. TBS - T 30 분 동안 막을 린스 (한 빠른 3 X 10 분 rinses 다음 린스).
    6. 흔드는에서 플라스틱 시트 보호 장치 사이에 보푸라기가없는 필터 종이에 여분의 시약을 얼룩 및 필름 카세트에 막을 장소, 5 분 갓 만든 SuperSignal 웨스트 피코 Electrochemiluminescence 시약 (ThermoFisher)에서 막을 품어. 먼지없는 Kimwipes 필요한 경우와 추가 SuperSignal 시약을 얼룩.
    7. 30 분정도 30 초 간격에 대한 코닥 Biomax MR 필름에 노출 및 필름 개발에 개발할 수 있습니다. 오분 후, Aβ 모노머 밴드는 아마 포화됩니다.
    8. 세포막은 복원에 떨고 플러스 실온에서 30 분 버퍼가 벗겨진하고 원하는 경우 추가 항체와 reprobed하여 (TBS - T에 rinsing 이후) 송두리째 수 있습니다.

    6 부 : 대표 Immunoblot :

    그림 1A
    그림 1B
    그림 1C
    7 인간의 과목에서 50μg 총 단백질을 포함하는 수치 1A - C. 명확히 homogenates는 multimeric Aβ와 APP의 존재에 대해 분석하고 있습니다. 항체 6E10와 Immunoblotting 것은 Aβ 단량체, dimers, trimers, tetramers, 그리고 알츠하이머의 경우 APP (상단 밴드)뿐만 아니라,이 광고의 경우에 풍부 고분자량 Aβ의 multimers를 보여줍니다. 합성 Aβ40은 낮은 분자량 밴드의 신원을 확인합니다. AD : 알츠하이머 질환, DLB : Nondemented 인간 (A) 30 분 필름 노출, (B) 5 분 필름 노출, (C) 30초 필름 노출 :. Lewy 기관, ND와 치매.

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    Discussion

    알츠하이머 병 1,4,5의 pathogenesis에서 Aβ 집합의 중요성에도 불구하고, 몇 가지 연구가 설명 또는 인간의 대뇌 피질의 조직 샘플 2 다양한 Aβ multimers의 분포를 계량 있습니다. 일반적으로 사용되는 immunohistochemical 기법은 고정 피질 조직에서 서로 다른 multimeric Aβ 종의 차별에 대한 허용하지 않습니다. 떼어낸 피질 조직 homogenates에서 Aβ multimers는 분리와 화학적 겔 전기 영동과 항체 기반의 탐지 방법을 사용 평가하실 수 있습니다. 그러나, 타겟으로하는 Aβ epitopes는 감지 및 집계 Aβ의 정확한 양을 정함 방지, 집계 및 사후 translationally 수정 펩타이드 구조 내에 숨겨져있을 수 있습니다. SDS - PAGE와 Aβ 6,7의 N - 터미널 지역에 항체와 immunoblotting와 결합하여 열을 유발 항원 에피토프 검색을 사용하여, 우리는 별도의 자연 인간의 두뇌에서 격리 Aβ multimers를 발생 감지할 수 있습니다. 명확히 조직 homogenates에 별개의 Aβ multimer 인구는 다음 densitometry로 계량하실 수 있습니다. 또한 함께 젤 또는 막 - 추출의 조합이 자연스럽게 발생의 자세한 구조 특성에 대한 immunoblotting Aβ 수, 사후 translationally 인체 조직에서 Aβ multimers을 수정했습니다. 그것은 인간 두뇌에서 Aβ multimers은 SDS - 강한, 또는 그들이 SDS 구분 따라서 정의된 조건 SDS 변성에 의해 작은 집계로 분해한다면 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 인간 두뇌의 집계 Aβ의 다양한 형태의 특성은 알츠하이머 질환에 대한 치료 및 생체에 대한 검색을 용이하게합니다.

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    Disclosures

    Acknowledgements

    일레인 Pranski 우수한 기술 지원 캐롤린 Suwyn와 해리 레빈 III, M. 폴 머피, 중요한 대화를 게어링 말라 많은 감사드립니다. 기금은 RR - 00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, 우드러프 재단과 에모리 대학 조사위원회에 의해 제공되었다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-29130 1 tablet in 25ml buffer
    BCA Protein Assay kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23225
    XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark Invitrogen EI0002
    Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) Invitrogen LC1676
    NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) Invitrogen NP0004
    SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard Invitrogen LC5925
    Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well Invitrogen EC6625BOX
    Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size Invitrogen LC2000
    Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) Invitrogen LC1675
    Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) Invitrogen LC3675
    SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 Will not interfere with immunostaining
    ATX Ponceau S Red staining solution Sigma-Aldrich 09276 Will not interfere with immunostaining
    Kapak heat sealable plastic sample pouches Fisher Scientific 0181225AA
    6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) Covance SIG-39320 Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB
    Tween 20 Sigma-Aldrich P2287
    ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Dilute at 1:10,000
    SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific, Inc. 34077
    Kodak Biomax MR Film Carestream Health 870 1302

    References

    1. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
    2. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
    3. Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
    4. Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
    5. Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers - a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
    6. Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
    7. Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).

    Comments

    2 Comments

    Good morning,
    I'm a Spanish technician, and just now I am working with a murine model of Alzheimer disease. Right now I²17;m trying to find the protein Aβ with western blot, and I am following your protocol since I think it²17;s very well explained.
    I am working with tricine gels, and I think they are better than the acrylamide-polyacrilamide ones. But I am having problems when I run the gel. I find fuzzy bands in some samples, but not in the others. I think it could be due to the lysis buffer where my samples are, which is different in one case and the other. The fuzzy bans correspond to a buffer with some detergents (1% Triton X-100 and 0,1% SDS), while the bands which run well are in a buffer without detergents. Do you really think that it might be an incompatibility between the tricine gel or the tricine SDS running buffer and my lysis buffer? I use the same sample buffer for the two kinds of samples.
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 23, 2012, 6:38 AM

    Hi Irene,

    We have performed Abeta western blots with Tricine gels using samples (human and nonhuman primate brain) homogenized with or without detergent and never had these issues. We did not use Triton, but ²% SDS-lysed samples ran cleanly. Perhaps you could lyse your samples in SDS alone?

    Are the fuzzy bands where you expect to see Abeta in the gel? What antibody are you using?

    Best,
    Rebecca
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 25, 2012, 8:26 AM

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