SDS-PAGE/Immunoblot检测人脑皮层组织中的Aβ多聚匀浆使用抗原表位检索

第1部分：澄清组织匀浆的制备

1. Dounce均质4次冰冷的缓冲液（0.1M磷酸盐缓冲生理盐水[钙+ + - 和镁+ + - 免费]加2个蛋白酶抑制剂的鸡尾酒[圣诞老人Cruz的]）体积不固定的皮质组织约30甚至杵中风（即加入400μl缓冲100毫克组织）。
2. 自旋匀浆为5分钟，在3000克（4℃）。小心取出-80澄清这些提取物的上清液和存储等分℃直至使用。
3. 确定使用一个bicinchoninic酸（BCA）法澄清的匀浆总蛋白浓度（微克/微升），根据制造商的说明（ThermoFisher）。

第2部分：SDS - PAGE样品制备

1. 10-20％甘氨酸凝胶（Invitrogen公司），可装载每口井的最大音量是一个10〜25μl。总成交量包括2X SDS样品缓冲液和10倍的还原剂，使每口井可装载的最大音量是澄清匀浆加入10μl。澄清20％（W / V）皮质匀浆应该有一个总蛋白浓度大于5微克/μL，让每孔50μg总蛋白。小于5mg/ml蛋白质样品，将需要装载总蛋白少，每口井。然而，高蛋白质水平检测单体和聚合的Aβ（50 -60μg总蛋白是最佳）的最佳选择。
   始终负载总蛋白相同的金额，每口井。
2. 对于每个凝胶，负载至少SeeBlue Plus2（Invitrogen公司），如分子量，加入10μl。作为阳性对照，运行10 - 100ng合成Aβ40或Aβ42肽（1xPBS稀释）在另一口井。
3. 准备上冰的反应混合物，使用刚刚解冻，澄清匀浆。 5-10秒的涡管，在干浴热在100 ° C，为5分钟，然后快速旋转所有的样本，以除去凝结在第。

第3部分：SDS - PAGE凝胶电泳

1. 加载到在10-20％的甘氨酸凝胶XCell确保锁迷你细胞Gelbox涡旋样本，采用甘氨酸SDS电泳缓冲液，根据制造商的说明（Invitrogen公司），
2. 运行在一个恒定的电压为125V约90分钟的凝胶。让样品的运行，直到4KDa标记带从凝胶底部约1厘米。

第4部分：将蛋白质从凝胶膜

1. 小心取出凝胶和塑料外壳内XCell II印迹模块组装转移夹心，根据制造商的说明（Invitrogen公司）。预湿的印迹垫和0.2μm的硝酸纤维素膜，Tris -甘氨酸转移缓冲液（20％甲醇），并删除任何气泡从印迹垫或过滤纸/膜夹心。
2. XCell Gelbox，填补内宅与传输缓冲区，并填写DIH _{2 O（}甲醇暴露可以穿塑料gelbox随着时间的推移）的外室。
3. 运行在一个恒定的电流为25mA的2-3个小时的转移。
4. 当传送完成后，解构三明治和凝胶进入_{DIH 2 O}和膜放入1xPBS，无论是在方形塑料培养皿（或其他合适的容器） 。
5. 为了可视化蛋白转移效率，凝胶可以染色只需蓝SafeStain（Invitrogen公司），并与丽春红红染色（西格玛Aldrich公司）的膜，无论是根据制造商的指示。这不会干预与免疫染色。如果染色揭示蛋白转移效率低下，修改在步骤3中的传输时间。

第5部分。抗原表位的检索和免疫印迹

1. 抗原修复在免疫抗体结合膜在揭示Aβ的抗原表位的重要一步。任何蒸锅，微波炉，或水洗澡，保持一个恒定的温度为100 ° C将足以。抗原检索在蒸笼，热密封膜在重型Kapak与1xPBS塑料填充袋，在室温下。莱平在预先加热的蒸笼袋;邮袋后，开始扩大，孵育一个额外的15分钟。允许膜慢慢冷却之前，从袋，防止过度起皱。
2. 在室温下，小心地取出热气腾腾的囊膜和冲洗1xPBS膜5分钟，其次是在TBS - T的5分钟冲洗（TRIS缓冲生理盐水，pH值8.0与0.05％Tween - 20的[适马] ），上轨道摇床。一小时孵育膜在封闭液（TBS - T的2.5％，脱脂牛奶），摇匀。如果不清洗，转印膜含有封闭液稀释的第一抗体（6E10 1:1,000 [1μg/ml1:5,000 [0.2μg/ml]稀释，Covance公司），避免泡沫的一盘菜或塑料袋第在室温下的轨道摇床孵育一小时，然后在4 ° C振荡（潜伏期较长，可能会提供更好的信号）。24-48小时
3. 膜冲洗30分钟，在TBS - T（快速冲洗3 × 10分钟的冲洗）。
4. 孵育膜HRP标记的第二抗体（羊抗鼠，Amersham公司的ECL GE医疗），在1:10,000在封闭液稀释为90分钟，在室温下振动筛，。
5. 膜冲洗30分钟，在TBS - T（快速冲洗3 × 10分钟的冲洗）。
6. 在摇床，孵育5分钟新鲜SuperSignal西碧电化学发光试剂（ThermoFisher）膜，无绒滤纸吸干多余的试剂，并在电影盒放置的膜，塑料板材保护之间。如有必要，无粉尘Kimwipes吸干额外的SuperSignal试剂。
7. 暴露在柯达百玛士致辞片长达30分钟30秒的时间间隔，在电影开发和发展。 5分钟后，Aβ的单体带可能会饱和。
8. 膜可剥离翻天覆地的还原，加上30分钟，在室温下剥离缓冲区和reprobed如果需要额外抗体（TBS - T冲洗后）。

第6部分：代表免疫印迹：

图1A - C。澄清的匀浆液，含有7人科目50μg总蛋白分析的多聚体的Aβ和APP的存在。免疫抗体6E10揭示Aβ的单体，二聚体，三聚体，四聚体，和应用程序在所有的老年痴呆症的情​​况下（顶部波段），以及丰富较高分子量在2例AD患者的Aβ多聚体。合成Aβ40证实低分子量乐队的身份。公元：阿尔茨海默氏症，DLB：Nondemented人类（一）30分钟的胶片曝光，（B）5分钟的胶片曝光，（C）30秒的胶片曝光：路易体，钕痴呆。

尽管Aβ聚集在阿尔茨海默氏病^1,4,5的发病机制中的重要性，很少有研究描述或量化分配不同的Aβ多聚体在人脑^皮层的组织样本2。常用的免疫组织化学技术不允许固定皮质组织中不同的多聚体的Aβ物种歧视。在不固定的皮质组织匀浆，Aβ的多聚体可以分离和生化评估使用凝胶电泳和抗体的检测方法。然而，有针对性的Aβ的抗原表位可能被隐藏在汇总和翻译后修饰的肽结构，防止聚集的Aβ检测和准确的定量。利用热诱导的抗原表位的检索，结合SDS ^- PAGE和6,7对Aβ的N -端区域的抗体免疫印迹，我们能够从人类大脑中分离的自然发生的Aβ多聚体分离和检测。不同澄清组织匀浆中的Aβmultimer种群，然后可以通过光密度量化。此外，凝胶或膜萃取相结合的Aβ免疫将使自然发生进一步的结构表征，翻译后修饰的Aβ多聚体从人体组织。这将是重要的，以确定是否在人类大脑中的Aβ多聚体SDS耐，或者如果他们SDS敏感，因此破碎成更小的聚集体，在规定条件下通过SDS变性。聚集的Aβ在人类大脑的形式多样的特性，将有助于为阿尔茨海默氏病的治疗和生物标志物的搜索。