Измерение 50% Гемолитическая Дополнение (CH ₅₀) Активность сыворотки

Подготовка 5x веронал буферного раствора (VBS)

1. Для подготовки веронал буферного раствора (VBS), три отдельных решения должны быть подготовлены.
2. Подготовка раствора 1, растворяя 21.25gm из NaCl и 0.94gm натрия Barbitone в 350 мл дистиллированной воды. Конечные концентрации NaCl и натрия Barbitone являются 1.02M и 13 мм соответственно.
3. Подготовка раствора 2, растворяя 1.44gm из Barbitone в 125 мл горячей дистиллированной воды. Конечная концентрация Barbitone является 62.5mM.
4. Подготовка раствора 3, растворяя 20.33gm из MgCl ₂ и 4.41gm из CaCl ₂ в 100 мл дистиллированной воды. Конечной концентрации MgCl ₂ и CaCl _2, 2.18M и 440мм соответственно.
5. Смешайте растворы 1 и 2 и охладить до комнатной температуры.
6. После совместного решения остынет, добавить 1.25ml решения 3 и регулировать рН до 7.3-7.5 использованием 1М HCl.
7. Отрегулируйте конечного объема 500 мл дистиллированной воды для приготовления 5x маточного раствора.
8. Для подготовки 1x рабочий раствор, развести акции 1:05 дистиллированной водой.

Сенсибилизация из эритроцитов барана с гемолизин

1. Подготовка гемолизин по во-первых разбавления 1:50 с VBS
2. Для 4 мл ЭБ добавить 6 мл на VBS и осторожно перемешайте инверсии
3. Центрифуга на 600 г х 5 минут
4. Удалите супернатант и промыть клетки еще 2 раза
5. После последней промывки, центрифуги клеток в 900 г 5 минут х упаковать клетки
6. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в достаточном VBS подготовить 10% раствор, т.е. 0,5 мл упакованных клеток ресуспендируют в 5 мл буфера
7. По каплям добавить равный объем гемолизин (кролик против овец красный антитела клеток крови) для клеток, закрученной непрерывно
8. Инкубировать при температуре 30 ° С в течение 30 минут на водяной бане
9. Аккуратно перемешайте клетки каждые 15 минут
10. Sensitised ЭБ, могут храниться в течение ночи при 4 ° С

CH ₅₀ анализа

1. Этикетка ряд труб в двух экземплярах с 1:08, 1:16, 1:32, 1:64 и 1:128.
2. Приготовьте серию в два раза серийных разведений контрольных и испытательных сыворотки в VBS каждый в двух экземплярах
3. Начало в 1:04 (100 мл сыворотки + 300 мл VBS) и передачу 200 мл образца в следующем помечены трубки.
4. Тщательно перемешать между разведения и передачи 200мл к следующему разбавления свежей кончика пипетки.
5. Повторяйте, пока все пять разведения делаются.
6. Отменить 200мл от окончательного 1:128 разбавления.
7. Добавить 200 мл приостановлено сенсибилизированных ЭБ во все пробирки.
8. Этикетка два отдельных труб как пустые и добавьте 200 мл сенсибилизированных ЭБ + 200 мл VBS. Эти трубки будут измерять спонтанного лизиса ЭБ в VBS.
9. Этикетка еще две отдельные трубы, ОБЩАЯ лизиса и добавить 200 мл сенсибилизированных ЭБ + 200 мл дистиллированной воды.
10. Аккуратно перемешайте все пробирки.
11. Инкубировать при 37 ° С в течение 30 минут в водяной бане смешивания через 15 минут.
12. Центрифуга образцов при 1500 г в течение 5 минут, чтобы осадок эритроцитов.
13. Передача 100 мл супернатант из каждой пробирки, чтобы хорошо в 96-плоским дном тарелку.
14. Добавить 100 мл дистиллированной воды в каждую лунку.
15. Измерить абсорбцию образцов при 540нм использованием пластины спектрофотометр.

Расчеты

1. Рассчитать среднюю оптическую плотность каждого образца
2. Вычтите BLANK абсорбции (спонтанного лизиса) из всех образцов
3. Рассчитать% лизис для каждого разведения по следующей формуле:
   
4. Участок процент лизиса (вертикальная ось) в зависимости от разведения сывороток на горизонтальной оси.
5. Расчет разбавления требуется на 50% гемолизу для контроля и испытания сыворотки (рис. 2).

Представитель Результаты:

Видео включает в себя пример представителя результаты. На практике контроль сыворотки также запустить в то же время в качестве тест-сыворотки и рассматривается в том же порядке. Ниже (табл. 1) приведен пример данных из протестированных образцов сыворотки. Данные манипуляции в соответствии с уравнением, представленные в 5,3.

Рисунок 1. Активация классического пути комплемента. Классический путь активируется путем связывания иммуноглобулина M (IgM) или иммуноглобулин G (IgG) на поверхности клетки-мишени. Fc части Ab связывается с C1q, C1R будет активирована, и это в свою очередь, активирует другой молекулой C1R которые вместе активирует две молекулы C1s. C1s теперь расщепляет С4, который предоставляет сайт связывания С2, который также расщепляется. Связывание C4b и C2a приводит к образованию комплекса называют конвертазы С3. Этот комплекс теперь расщепляет C3 формирования C3a и C3b, некоторые из которых в сочетании с конвертазы C3 формирования конвертазы C5. Этот комплекс в настоящее время действует на С5, с результатом C5b привязки к C6 начало образованию комплекса мембранной атаки (MAC). C5b6 действует на C7, который в свою очередь воздействуют на С8 и в конечном счете на C9 в результате формирования окончательной MAC. (Goldsby и др., 2003).

Рисунок 2. Построение выборки данных и расчета CH50 для контроля и испытания образцов сыворотки. (А), рассчитанный в процентах (%) лизис и управления (•) и тест () образцах сыворотки показаны в зависимости от разбавления фактор. (Б) Для расчета 50% лизиса, линия рисуется от 50% процентов значения, до пересечения с графиком линии, а затем вертикальная линия до разбавления. В этом примере 35-кратного разбавления контроля и 21,6 раза разведения теста сыворотки, необходимой для достижения 50% лизиса. Эти данные показывают, что там меньше дополнением присутствуют в сыворотке тест по сравнению с контролем, как это требуется меньше разбавление до 50% лизиса была достигнута. Контрольная проба также показывает,> 100% лизиса в разведении 1:8. Скорее всего, это из-за неполного лизиса ЭБ на дистиллированную воду и более эффективное лизис компонентов комплемента.

CH ₅₀ анализа подлежит много помех. Некоторые ЭБ более хрупки, чем другие, в результате спонтанного гемолиза, что не имеет отношения к дополнять деятельность. Сродство антител кролика варьируется от партии к партии и от одного производителя к другому, это влияет на количество антител, которые связываются с ЭБ. Кроме того, процесс информирования ЭБ с антителами приводит к клеткам с разным количеством антител покрытие ЭБ. Сбор и хранение образцов являются важным потенциальным источником ошибок. Компонентов комплемента например C1q, C3, C4 и C5 чрезвычайно лабильны, поэтому надлежащим образцом обработки имеет решающее значение. Длительное воздействие тепла снизится дополнять деятельность и будет производить неактивные фрагменты компонентов комплемента. Чтобы определить, как многие источники ошибок, как это возможно, имеет решающее значение для проверки контрольной сыворотки с известным CH ₅₀ значение каждый раз, когда анализ проводится и воспроизводить принято значение известно контрольной сыворотки. Один из способов определить, если Есть ли различия между различными партиями и ЭБ гемолизин том, чтобы проверить новые тестовые материалы против стандартного образца сыворотки несколько раз, и затем определить, если Есть любые изменения в базального уровня гемолиза или CH ₅₀ значение для контрольной сыворотки.