调查组织和器官特定的光敏色素反应，使用流式细胞仪辅助细胞类型特定的表达谱拟南芥

Sankalpi N. Warnasooriya¹, Beronda L. Montgomery^1,2

¹Department of Energy - Plant Research Laboratory, Michigan State University (MSU), ²Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University (MSU)

1。植物生长

1. 证实UAS -超视距X GAL4 - GFP增强陷阱线隔离^4（对于总结见图1）和野生型或亲土壤播种，即〜2000年，每行消毒的种子。
2. 植物生长5周^{100μmolm-2 s} - 1时的白色照明下对土壤在22℃，湿度70％ 。

2。叶原生质体分离（改编自⁹ Denecke和Vitale的）

1. 为了分离原生质体，准备TEX的缓冲区。对于1公升TEX的缓冲区，掂量出了以下组件：3.1克Gamborg的B5的盐，0.5 G 2 - （N -吗啉）ethanesulfonic酸（MES，2.56 mM的），0.75克钙氯化物二水（氯化钙₂ .2 H ₂ Ø，6.75毫米），0.25克的硝酸铵_{（NH 4 NO} 3，3.12毫米），136.9克的蔗糖（0.4M）。溶解组件完全〜900毫升的去离子水，蒸馏水_（DDH 2）和带1至5.7的pH值中号氢氧化钾。使最终体积为1升和0.2微米瓶顶过滤连接真空泵过滤消毒。
2. 收集绿色，健康的植物的叶子（〜250毫升的树叶在烧杯中松散包装）〜40毫升_{DDH 2} O 4次冲洗，随后用无菌_{DDH 2} O冲洗两次使用＃20手术刀，切叶，切成细条，平分到两个50毫升的无菌塑料管组织。准备加入5毫升分装10X叶消化库存解决方案（10X叶消化库存解决方案的1X叶消化混合溶于2％W / V Macerozyme的R - 10，4％W / V“Onozuka”纤维素酶在TEX缓冲的R - 10，过滤消毒用0.2微米的过滤器和冻结5毫升分装于-80 ° C）45毫升新鲜的TEX缓冲区。新增〜25毫升1X叶，每50毫升的管覆盖所有叶片组织消化混合。
3. 真空渗透在开放的管叶组织，在消化的混合物在室温下用真空干燥器连接到一台水泵，在室温下孵育3小时上轻轻摇动摇杆为1小时。回报上限的叶组织1X叶消化混合管保持在铝箔包裹在此过程中，以防止暴露在光线下。
4. 经过3个小时，增加1〜2分钟释放原生质体的摇杆速度。原油原生质体悬浮液通过两层无菌纱布过滤，清除杂物，并在无菌的玻璃烧杯收集滤液。通过无菌100微米尼龙网过滤，滤液进入无菌培养皿。收集流过，并转移到一个新的无菌50毫升管。约15-20毫升新鲜TEX的缓冲区，使用洗无菌培养皿中，并收集任何原生质体坚持表面。
5. 离心机的流量，通过使用100xg摆动斗转子在10℃15分钟（6加速，减速0）彗星。
6. 删除〜25 - 30毫升液体低于浮动原生质体层，其中含有残留和颗粒碎片，用无菌9“玻璃巴斯德吸管连接互不干扰浮动原生质体层和离开〜10蠕动泵 - 15毫升量。
7. 补充新鲜TEX缓冲区的最后一个40毫升的量，一边轻轻resuspending的原生质体。
8. 重复步骤2.5至2.7的两倍，以去除尽可能多的细胞碎片。离心时间缩短至10分钟，在第一次重复，并在最后重复5分钟。
9. 削减，到一个新的15毫升管1毫升无菌移液管吸浮原生质体。直接进行排序或在黑暗的存储长达2个小时在4℃，直到排序彗星。

3。原生质体的排序由荧光激活细胞分选（FACS）

1. 排序之前，检查原生质体激光共聚焦显微镜（CLSM）使用488纳米的激光激发确认原生质体的完整性和绿色荧光的原生质体池的存在。最小的碎片是必要的，以避免堵塞流式细胞仪排序喷嘴。
2. 排序分离出原生质体在TEX缓冲区通过流式细胞仪（BD FACSVantage SE，BD Biosciences公司）与适应协议¹⁰磅约9的系统压力，使用200微米的喷嘴事件的发生率在6000和15000之间的宏观排序头。
3. 野生型非GFP原生质体是用来确定的自体荧光阈值。
4. 为了收集GFP阳性的原生质体，排序使用488纳米氩线的空气冷却的氩激光（光谱物理模型177，新港公司，加利福尼亚州欧文）在100毫瓦经营，使用的三十分之五百三十频段，以确定GFP荧光的细胞通滤波器。
5. GFP阳性原生质体的集合，检查CLSM详细步骤3.1排序原生质体。
6. 从排序使用Qiagen公司的RNeasy植物试剂盒的原生质体中提取总RNA。然后可以准备杂交基因Affymetrix基因芯片Expr之间ession分析技术手册“和”杂交ATH1 Affymetrix的拟南芥全基因组阵列。

代表性的成果

我们发现了大量GFP阳性细胞，用流式细胞仪（图2）的绿色荧光蛋白通道。在使用GFP增强子陷阱家长，组成表达GFP的线，J0571，显示〜17％至24％的GFP阳性的原生质体，而与血管和皮肤的表达，J1071，〜1.4％GFP阳性的原生质体的优化分析（见表1）。 3 × 500μLJ0571的原生质体（〜1.5毫升的总原生质体悬浮）排序了1小时〜10万的GFP阳性的原生质体。 3 × 500μLJ1071的原生质体（1〜1.5毫升总原生质体悬浮液）的排序为1.5小时，给〜3000 GFP阳性的原生质体。共聚焦显微镜图像显示为J0571和J1071样品原生质体非常高的收益率，然后再排序进行了（图3C和3E），并排序分数中唯一明亮的绿色荧光蛋白荧光的原生质体（图3G和数据未显示）。这一发现证实了GFP阳性的，完整的原生质体可通过流式细胞仪进行排序。非GFP的原生质体，也可以进行排序和收集在一个单独的通道。非GFP的原生质体作为一个理想的后续芯片分析阴性对照检测后在基因表达的具体变化，减少holophytochrome水平。 RNA提取原生质体（1毫升）RNA的检测fluorospectrometry（图4）有足够数量的产量。分离出的RNA使用NanoDrop仪（Thermo Scientific的NanoDrop 1000）进行了评估和量化NanoDrop 3.7.1 RNA定量软件。 RNA的产量从预先排序C24的野生型原生质体或流式细胞仪分选GFP阳性增强陷阱原生质体超过使用所需的最低20吴标签RNA检测微阵列（见表2）。

表1。两个增强子陷阱排序和运行500原生质体悬浮液通过荧光激活细胞分选（FACSVantage，BD）收集的GFP阳性原生质体的数量前行的GFP阳性原生质体的百分比。

表2。产量从原生质体RNA隔离。预先排序的C24的野生型或排序从两个增强子陷阱线GFP阳性原生质体RNA的提取和量化。

图1。GAL4增强子陷阱的胆绿素还原酶（BVR）在转基因拟南芥植物中的表达诱导。 （一）。 GAL4基于增强陷阱线，其中包含一个GAL4反应GFP标记基因，从库中选择一个个人可以跨过一个含有GAL4反应的靶基因，诱导靶基因的表达行GAL4含细胞标记GFP荧光。从吉姆博士Haseloff（http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html）图的基础上。 （b）生产的光敏色素生色，phytochromobilin（PΦB）和holophytochrome父行。 （c）留，分别由胆绿素还原酶（BVR）活动，BR和PΦR，胆绿素IXα（BVIXα）和PΦB减少。 PΦB枯竭超视距活动的结果，并导致在减少生产的光敏holophytochrome。右，超视距催化反应。

图2。荧光激活细胞分选（FACS）收购点图。 C24的野生型（A），J0571（B）和J1071（三）原生质体细胞的比较排序。 （a）收购非GFP的荧光C24野生型激发488 nm的氩离子激光和用于确定自体荧光门槛的原生质体的散点图。 （B）和（c）收购点图显示原生质体的488 nm激光的响应激发GFP的阳性比例。 R3的排序盖茨在B和C划定GFP阳性排序荧光激活细胞分选（FACSVantage，BD）和收集的目标。红色通道表示v叶绿素从原生质体的自体荧光和绿色通道alues​​表明GFP荧光的值。

图3：用于细胞分选的植物原生质体共聚焦显微镜。共聚焦激光扫描前（A，C，E），后（G）的排序通过荧光激活细胞分选（FACS）原生质体的图像。 B，D，F和H DIC的图像。 C24野生型（A，B），（C，D）的J1071和J0571（E，F，G，H）的原生质体。图片C，E和G是合并后的GFP荧光（BP 505纳米 - 575纳米）和自体荧光（LP 650纳米）从488 nm激光激发获得的图像。 A到H的平均4下63X石油扫描。酒吧= 10微米。

图4由fluorospectrometry原生质体分离出的RNA定量。 （一）C24的野生型，（二）J0571，和（C）J1071 RNA提取。 A表示预排序的野生型原生质体的RNA。 B和C表示从荧光激活细胞分选（FACS）排序GFP阳性原生质体的RNA。 RNA定量分析软件，NanoDrop 3.7.1（Thermo Scientific的NanoDrop 1000）。