Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana

Sankalpi N. Warnasooriya¹, Beronda L. Montgomery^1,2

¹Department of Energy - Plant Research Laboratory, Michigan State University (MSU), ²Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University (MSU)

1. Plant Groei

1. Bevestigd UAS-BVR X GAL4-GFP enhancer geïsoleerd trap lijn zoals beschreven ⁴ (voor samenvatting zie Fig. 1) en de wild-type-of ouderschapsverlof lijnen zijn gezaaid op aarde, dat wil zeggen ~ 2000 gesteriliseerd zaden per lijn.
2. Planten worden gekweekt voor 5 weken op bodem onder witte verlichting van 100 μmolm ^-2 s ^-1 bij 22 ° C en 70% luchtvochtigheid.

2. Leaf protoplast Isolatie (aangepast uit Denecke en Vitale ⁹⁾

1. Te isoleren protoplasten, voor te bereiden TEX buffer. Voor 1 liter TEX buffer, wegen uit de volgende onderdelen: 3,1 g Gamborg's B5 zouten, 0,5 g 2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur zuur (MES, 2,56 mM), 0,75 g calciumchloride-dihydraat (CaCl ₂ .2 H ₂ O, 6,75 mM), 0,25 g ammoniumnitraat (NH ₄ NO _3, 3,12 mM), 136,9 g sucrose (0,4 miljoen). volledig oplossen componenten in ~ 900 ml gedeïoniseerd, gedistilleerd water (DDH ₂ O) en breng de pH op 5,7 met een M KOH. Breng uiteindelijke volume van 1 liter en filter steriliseren met een 0,2 um fles-top filter aangesloten op een vacuümpomp.
2. Verzamel groene, gezonde bladeren van planten (~ 250 ml van de bladeren los verpakt in een bekerglas) en spoel met ~ 40 ml DDH ₂ O 4 keer, gevolgd door spoelen tweemaal met steriele DDH ₂ O. Met behulp van een # 20 scalpel, gesneden blaadjes in dunne reepjes en verdeel het weefsel even in twee 50 ml steriele plastic buizen. Bereid 1x blad spijsvertering mengsel door toevoeging van 5 ml van 10x blad spijsvertering stockoplossing (10x blad spijsvertering voorraad: los op 2% w / v Macerozyme R-10, 4% w / v Cellulase "Onozuka" R-10 in TEX buffer, filter steriliseren met 0,2 um filter en 5 ml porties invriezen bij -80 ° C) tot 45 ml vers TEX buffer. Voeg ~ 25 ml 1x blad spijsvertering mix per 50 ml tube om alle bladweefsel te dekken.
3. Vacuüm infiltreren bladweefsel in de spijsvertering mengsel in open buizen voor 1 uur bij kamertemperatuur met behulp van een vacuümexsiccator aangesloten op een waterpomp, gevolgd door 3-uur incubatie bij kamertemperatuur op een rocker met een zacht schudden. Capped buizen met bladweefsel in 1x blad spijsvertering mix worden gehouden gewikkeld in aluminiumfolie tijdens dit proces om blootstelling aan licht te voorkomen.
4. Na 3 uur, verhoging van de rocker snelheid van ~ 2 minuten protoplasten vrij te geven. Filter de ruwe protoplast schorsing door de twee lagen van steriele kaas doek om vuil te verwijderen en het filtraat verzamelen in een steriele glazen beker. Filter het filtraat door middel van een steriele 100-um mesh nylon in een steriele petrischaal. Verzamel de stroom door en breng het naar een nieuwe steriele 50 ml buis. Gebruik ongeveer 15-20 ml vers TEX buffer om de steriele petrischaal wassen en eventuele protoplasten zich te houden aan het oppervlak te verzamelen.
5. Centrifugeer de stroom door het gebruik van een schommel emmer rotor op 100xg bij 10 ° C gedurende 15 minuten (Acceleration 6, Deceleration 0).
6. Verwijder ~ 25 - 30 ml van de vloeistof onder de drijvende protoplast laag, die rest-en gepelleteerd puin bevat, met een steriele 9 "glas Pasteur pipet verbonden met een peristaltische pomp zonder de drijvende protoplast laag en het verlaten van ~ 10 - 15 ml volume.
7. Voeg verse TEX buffer tot een uiteindelijk volume van 40 ml, terwijl zachtjes resuspenderen de protoplasten.
8. Herhaal de stappen 2,5 tot 2,7 twee keer zo veel cellulaire vuil te verwijderen mogelijk te maken. De centrifugeertijd wordt teruggebracht tot 10 minuten in de eerste herhaling en tot 5 minuten in de laatste herhaling.
9. Aspireren drijvende protoplasten met een cut, steriele 1 ml transferpipet naar een nieuwe 15 ml buis. Ga direct naar het sorteren of op te slaan in het donker tot 2 uur bij 4 ° C tot sorteren.

3. Protoplast Sorteren op Fluorescentie-Activated Cell Sorting (FACS)

1. Voor het sorteren, te onderzoeken protoplasten door Confocale Laser Scanning Microscopie (CLSM) met behulp van een 488-nm laser voor excitatie te protoplast integriteit en de aanwezigheid van GFP fluorescentie in de protoplast zwembad te bevestigen. Minimale puin is nodig om te voorkomen verstopping van de FACS-sortering mondstuk.
2. Sorteer geïsoleerde protoplasten in TEX buffer via FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) met behulp van een 200-um mondstuk op een macro soort hoofd event rates tussen 6.000 en 15.000, met een systeem de druk van ongeveer 9 psi na een aangepast protocol ^10.
3. Wild-type niet-GFP protoplasten worden gebruikt om de autofluorescentie drempelwaarden vast te stellen.
4. Om GFP-positieve protoplasten, een soort cellen met behulp van een luchtgekoelde argon laser (Spectra Physics Model 177, Newport Corporation, Irvine, CA) die worden geëxploiteerd op 100 mW op een 488-nm argon lijn om GFP-fluorescentie te identificeren met behulp van een 530/30 band te verzamelen pass filter.
5. Na het verzamelen van GFP-positieve protoplasten, onderzoeken gesorteerd protoplasten door CLSM zoals beschreven in stap 3.1.
6. Extract totaal RNA van gesorteerde protoplasten met behulp van een Qiagen RNeasy Plant Mini Kit. cDNA kan dan worden voorbereid voor hybridisatie, zoals beschreven in Affymetrix GeneChip Expression Analyse technische handleiding en vervolgens gehybridiseerd met AtH1 Arabidopsis Affymetrix hele genoom van arrays.

Representatieve resultaten

We hebben gedetecteerd een groot aantal GFP-positieve cellen in het GFP-kanaal door FACS (afb. 2). In optimalisatie testen met behulp van GFP enhancer-trap ouders, het constitutief GFP-expressie lijn, J0571, weergegeven ~ 17% tot 24% GFP-positieve protoplasten, terwijl de lijn met vasculaire en dermale expressie, J1071, had ~ 1,4% GFP-positieve protoplasten (tabel 1). Sorteren van 3 x 500 pi (~ 1,5 ml in totaal protoplast schorsing) van J0571 protoplasten gedurende 1 uur gaf ~ 100.000 GFP-positieve protoplasten. Sorteren van 3 x 500 pi (~ 1,5 ml in totaal protoplast schorsing) van J1071 protoplasten gedurende 1,5 uur gaf ~ 3000 GFP-positieve protoplasten. Confocale beelden aangegeven een zeer hoge opbrengst van protoplasten voor zowel de J0571 en J1071 monsters voor sorteren werd uitgevoerd (Fig. 3C en 3E), en de gesorteerde fracties bevatte slechts lichte GFP-fluorescentie protoplasten (Fig. 3G en gegevens niet getoond). Deze bevinding bevestigt dat intact GFP-positieve protoplasten kunnen worden gesorteerd via FACS. De niet-GFP protoplasten kunnen ook worden gesorteerd en verzameld in een apart kanaal. De niet-GFP protoplasten dienen als een ideaal negatieve controle voor latere microarray analyses aan de specifieke veranderingen in genexpressie te detecteren na verlaging van holophytochrome niveaus. RNA-extractie uit geïsoleerde protoplasten (1 ml) geeft RNA van voldoende hoeveelheid voor detectie door fluorospectrometry (afb. 4). Geïsoleerde RNA werd gemeten met een NanoDrop instrument (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) en gekwantificeerd door NanoDrop 3.7.1 RNA kwantificatie software. RNA opbrengsten van voorgesorteerd C24 wild-type protoplasten of FACS-gesorteerd, GFP-positieve enhancer trap protoplasten boven het minimum 20 ng die nodig zijn voor gebruik in de RNA-etikettering van assays voor microarray (tabel 2).

Tabel 1. Percentage van GFP-positieve protoplasten van twee enhancer trap rijen voor het sorteren en het aantal GFP-positieve protoplasten verzameld door het uitvoeren van 500 pi van protoplast schorsing door de Fluorescence Activated Cell Sorter (FACSVantage, BD).

Tabel 2. Opbrengst van de RNA isolatie van protoplasten. RNA werd geïsoleerd uit voorgesorteerd C24 wild-type of gesorteerd GFP-positieve protoplasten van twee enhancer trap lijnen en gekwantificeerd.

Figuur 1. GAL4 enhancer-trap-op basis van inductie van biliverdine reductase (BVR) expressie in transgene Arabidopsis thaliana planten. (A). Een individuele geselecteerd uit een bibliotheek van GAL4-based enhancer trap lijnen, die een GAL4-responsieve GFP-marker-gen bevatten, kunnen worden gekruist met een regel met een GAL4-responsieve doelwitgen om expressie van het target-gen te induceren in GAL4-bevattende gemarkeerde cellen door de GFP fluorescentie. Op basis van een figuur van Dr Jim Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) De productie van fytochroom chromofoor, phytochromobilin (PΦB) en holophytochrome in ouder lijnen. (C) Links, Vermindering van biliverdine IXα (BV IXα) en PΦB door biliverdine reductase (BVR) activiteit aan BR en PΦR, respectievelijk. BVR activiteit leidt tot uitputting van PΦB en leidt tot een vermindering van de productie van fotoactieve holophytochrome. Rechts, is de reactie gekatalyseerd door BVR getoond.

Figuur 2. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) overname dot percelen. Vergelijking van de protoplast celsortering voor C24 wild-type (A), J0571 (B) en J1071 (C). (A) Overname dot plot van de niet-fluorescerende GFP C24 wild-type protoplasten opgewekt door een 488-nm argon laser en worden gebruikt om autofluorescentie drempel te bepalen. (B) en (C) het verwerven dot plots tonen proporties van protoplasten die GFP positieve reactie op excitatie door een 488-nm laser. R3 sorteren poorten in B en C af te bakenen van de GFP-positieve doelen die zijn gesorteerd op Fluorescentie-Activated Cell Sorter (FACSVantage, BD) en verzameld. Rode kanaal geeft vAARDEN voor chlorofyl autofluorescentie van protoplasten en groene kanaal geeft waarden voor GFP fluorescentie.

Figuur 3. Confocale microscopie van plantenprotoplasten gebruikt voor celsortering. Confocale laser beelden van protoplasten gescand voordat (A, C, E) en na (G) sorteren via fluorescentie-Activated Cell Sorter (FACS). B, D, F en H zijn DIC beelden. Protoplasten van de C24 wild type (A, B), J1071 (C, D) en J0571 (E, F, G, H) worden getoond. Afbeeldingen C, E en G zijn samengevoegd beelden van GFP fluorescentie (BP 505 nm - 575 nm) en autofluorescentie (LP 650 nm) verkregen van excitatie met een 488-nm laser. A tot en met H zijn gemiddeld vier scans onder 63x olie. Bar = 10 urn.

Figuur 4. Kwantificering van RNA geïsoleerd uit protoplasten door fluorospectrometry. RNA geëxtraheerd uit (A) C24 wild type, (B) J0571, en (C) J1071. A geeft RNA voor pre-gesorteerde wild-type protoplasten. B en C geven aan RNA van GFP-positieve protoplasten gesorteerd op Fluorescentie-Activated Cell Sorting (FACS). RNA kwantificatie software, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).