Analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un Self-Made Apparato Cytospin

Parte 1: Sospensione colorazione immunocitochimica

1. Le cellule sono raccolte in una sospensione di cellule singole.
2. Le cellule sono poi trasferiti in 1,5-microcentrifuga da 2 ml tubi e centrifugati a 200g per 4 minuti.
3. Le cellule sono lavate aspirando fuori surnatante, risospesi in 1 ml di PBS - (senza Mg ^{2 +} e Ca ^{2 +)} e poi centrifugati nuovamente a 200g per 4 minuti. Questo dovrebbe essere fatto due volte.
4. Dopo il lavaggio, le cellule vengono poi fissati dalla ri-sospensione in 1 ml di paraformaldeide 4% (PFA) a temperatura ambiente per 10 minuti.
5. Le cellule sono lavate di nuovo per due volte con 1 ml di PBS -.
6. Dopo il lavaggio, le cellule blocco per ri-sospensione in 1 ml di soluzione di blocco (6% serum/94% PBS -). Incubare questi a temperatura ambiente per 45 minuti.
7. Dopo, centrifugare le provette a 200 g per 4 minuti e aspirare fuori Solution Block. Risospendere le cellule in 1 ml della soluzione di anticorpo primario (fatta con la soluzione al blocco di diluizione consigliato). Le celle possono essere incubate a temperatura ambiente per 1 ora o a 4 ° C per una notte prima di procedere alla fase successiva.
8. Le cellule vengono poi lavate due volte con 1 ml di soluzione di blocco.
9. Dopo, risospendere le cellule in 1 ml di soluzione di anticorpo secondario (fatta con la soluzione al blocco di diluizione consigliato) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
10. Dopo 1 ora, le cellule devono poi essere lavate di nuovo due volte con 1 ml di soluzione di blocco.
11. Dopo il lavaggio con la soluzione di blocco, lavare le cellule di nuovo con 1 ml di PBS -.
12. Dopo i lavaggi vari, risospendere le cellule in 1 ml di DAPI nucleare macchia (1:10.000 diluizione del DAPI in PBS -) e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
13. Dopo 5 minuti, centrifugare le provette a 200 g per 4 minuti. Aspirare la soluzione nucleare DAPI macchia e risospendere le cellule in 1 ml di PBS -.

Incorporazione di hPSCs nelle diapositive generate attraverso apparato cytospin: parte 2

1. Slitte di plastica vengono preparati facendo la quantità desiderata di fori con un trapano a colonna. Il diametro deve essere al massimo 1 millimetro più grande del diametro massimo della punta micropipetta (s) da utilizzare.
2. Carta da filtro viene tagliata ai parametri del vetrino di plastica con le forbici.
3. I fori vengono poi realizzati in carta da filtro. La dimensione del foro (s) deve essere abbastanza grande che la punta micropipetta (s) si adatta snuggly attraverso di essa.
4. Dopo, una delle diapositive plastica preparato è posizionato sulla parte superiore e una lastra di vetro in posto al fondo della carta filtro taglia (Figura 1). Gli strati sono fissati con nastro adesivo.
5. Un massimo di 100μL (a seconda della densità monostrato desiderato) di sospensione cellulare macchiato da parte 1 viene posto nella parte superiore della punta micropipetta (s).
6. Se necessario, l'apparato con una soluzione di cella può essere pesato e un contro-bilanciamento di peso simile creato.
7. L'apparato cytospin e contro-equilibrio può vengono quindi inseriti in una centrifuga desktop e centrifugato a 200g per 4 minuti.
8. Dopo la centrifugazione, l'apparato cytospin viene accuratamente smontata in un modo che doesnt rimuovere le cellule dal vetrino.
9. Se necessario, l'eccesso di PBS circostanti - dalla parte di vetro in aspirato fuori.
10. Le celle possono poi essere visualizzati con un microscopio a fluorescenza per verificare se il monostrato cellulare desiderato è stato raggiunto.

Parte 3: scivoli di montaggio

1. Una goccia del supporto di montaggio desiderata viene inserito direttamente nel centro di ogni area contenente le cellule.
2. Dopo, una scivolata coperchio è abbassato delicatamente sul diapositive cercando di evitare bolle d'aria, se possibile.
3. Eccesso di mezzi di montaggio viene quindi rimosso da diapositive.
4. Dopo, i lati del coprioggetto sono sigillati con smalto.
5. Le slide possono essere conservati in un deposito scuro finché i risultati sono stati osservati e documentati.

Ai fini del nostro laboratorio, un piatto di 35 mm di colture di cellule staminali coltivate su fibroblasti embrionali del mouse (MEF) è assegnato per la procedura di colorazione immunocitochimica per l'utilizzo con l'apparecchio cytospin. Le cellule sono poi raccolti tramite enzimatica passaging, eliminando quanto più dello strato MEF possibile, in una cella singola sospensione. Se è più efficace isolamento delle cellule staminali dallo strato MEF si desidera, le colonie possono essere raccolte manualmente poi digerito in sospensione. Se le condizioni di alimentazione liberi sono utilizzati in crescita le culture di cellule staminali, le colonie possono semplicemente essere raschiata e digerito in sospensione. Mentre una prima cella singola sospensione è l'ideale, eventuali grumi cellulari dovrebbe effettivamente essere frantumata, numerosi in tutto il lavaggio e la risospensione passi richiesto nella procedura di colorazione immunocitochimica.

Il video si è concentrato sull'uso di marcatori extracellulare per hPSCs colorazione. Se la colorazione intracellulare del hPSCs si desidera, un ulteriore passaggio prima dell'aggiunta della soluzione di blocco (Punto 1.6) deve essere fatto in cui le cellule vengono lavate in 1 mL di soluzione di permeabilizzazione (50mLs di tampone di sale con 25μL di Tween 20) per tre volte prima di ri-sospensione in soluzione di blocco. Un altro punto critico che dovrebbe essere menzionato è che dal punto 1,9 della procedura, occorre prestare attenzione nel ridurre al minimo l'esposizione alla luce per i campioni per evitare lo sbiancamento fluorescenza dell'anticorpo secondario e DAPI nucleare macchia.

A causa delle numerose lavaggio e risospensione fasi della procedura, un piatto intero 35mm con una buona quantità di colonie staminali passaggio pronti per cellulari, stima che circa 400k-600k cellule, si raccomanda di essere digeriti e utilizzati nella sospensione iniziale . Questo viene fatto in previsione di una perdita di cellule a causa della natura della procedura. Teoricamente, una quantità molto più piccola di cellule possono essere utilizzate nella sospensione iniziale, ma una quantità extra di cura deve essere presa al fine di minimizzare ulteriormente la perdita di cellule. Durante il caricamento sul dispositivo cytospin dopo la procedura di colorazione immunocitochimica, una densità cellulare di 10k-50k è l'ideale. Va ricordato che, mentre 100μL è l'importo massimo che può essere caricato su un apparato cytopsin che utilizza un 0.1μL 10μL punta micropipetta, una piccola quantità (circa 20μL - 30μL) contenente la densità ideale cellulare è raccomandato. Questo riduce al minimo di overflow inutili di liquido sul vetrino. Infine, quando si utilizza l'apparato cytospin con la centrifuga, fino a quando l'apparecchio è sicuro di movimento laterale, la forza creata dalla centrifuga durante l'esecuzione ha, a nostra conoscenza, è stata sufficiente a mantenere l'apparato da lanciare o cadere.

Ingredienti per soluzioni utilizzate nella procedura immunocitochimica:

1. 2% paraformaldeide (PFA) / 2% saccarosio
   1. Aggiungere 75 ml di acqua distillata, e posto sul piatto mescolare riscaldata a 56 ° C.
   2. Pesare 2 g PFA, e aggiungere al bicchiere di vetro.
   3. Pesare 2 g di saccarosio, e aggiungere a PFA in bicchiere di vetro.
   4. Aggiungere 2 gocce di idrossido di sodio 1M.
   5. Una volta che tutti i reagenti sono andati in soluzione, aggiungere 10 ml di PBS 10X + +.
   6. Regolare il pH della soluzione a 7,2-7,4.
   7. Portare il volume a 100 ml con acqua distillata.
      Conservare a 4 ° C, ed utilizzare entro 1 settimana. Aliquote possono essere memorizzati @ -20 ° C per 1 mese. Centrifugare brevemente dopo lo scongelamento di togliere qualunque precipitato.
2. Blocco Soluzione (10 ml)
   1. Aggiungere 9,4 ml di PBS -.
   2. Aggiungere 0,6 ml di siero per la PBS -. (Questo può avere bisogno di essere ottimizzato per ogni anticorpo).
      Conservare a 4 ° C, ed utilizzare entro 48 ore.