Cronico Salmonella Modello mouse infetti

Questo protocollo comprende tre parti: rilevamento di coltura batterica, gavage mouse e Salmonella.

1. Salmonella condizione di crescita.

1. Preparare la Salmonella brodo Luria-Bertani (LB) piastra, incubare a 37 ° C durante la notte.
2. Scegli un clone dalla piastra LB e mettere in 7 ml di LB in una provetta da 12 ml, e si agita a 37 ° C per circa 5 ore.
3. Inoculare 50 LB ml con 0,05 ml di una cultura fase stazionaria e incubare a 37 ° C senza agitazione per circa 18 ore.
4. Spin coltura batterica durante la notte a temperatura ambiente con 6000 rpm per 10 minuti, sospendere i batteri in HBSS con rapporto di 100:3 (LB: HBSS). Per esempio:
   Ogni cultura LB 50 ml saranno sospesi in 1,5 ml HBSS.
5. Per la sonda gastrica animale, diluire ulteriormente la coltura batterica in rapporto 1:10. Per esempio:
   Ogni 1,5 ml di coltura LB saranno sospesi in 15 ml HBSS.

2. Salmonella infezione modello *.

1. Preparare la soluzione di streptomicina. Ogni mouse sarà dato 7,5 mg di streptomicina in 100 microlitri HBSS. Per esempio, preparare totale 90 mg di streptomicina in 1,2 ml di HBSS per 10 topi. Hanno sempre qualche volume in più quando si prepara la soluzione di streptomicina.
2. Prelevare acqua e cibo 4 ore prima della terapia orale sonda gastrica.
3. Topi sonda gastrica con streptomicina con 7,5 mg di streptomicina (100 ml di HBSS per topi di controllo). Afferra la pelle sopra la spalla del mouse saldamente con il pollice e il medio, allungare la testa e il collo con il dito indice per fare l'esofago dritto. Diretto la palla-punta dell'ago alimentazione lungo il tetto della bocca e verso il lato destro della parte posteriore della faringe, poi passare delicatamente giù nell'esofago e iniettare i 100 ul di soluzione. Nessuna resistenza deve essere sentito.
4. A 20 ore dopo il trattamento streptomicina, acqua e cibo ritirato ancora prima che i topi infettati con batteri.
5. Gavage ogni mouse con 100 microlitri di sospensione HBSS o trattati con HBSS sterile (controllo) mediante sonda gastrica. La procedura di sonda gastrica è lo stesso 2.3) topi sonda gastrica con streptomicina.

* Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti utilizzando specifici-esenti da organismi patogeni C57BL femmina / 6 topi (Taconic, Hudson, NY) che sono stati 6-7 settimane di età come descritto in precedenza ^1. Il protocollo è stato approvato dalla University of Rochester University commissione per le risorse animali (UCAR).

3. Rilevamento di Salmonella nell'intestino.

1. Raccogliere il mouse fecale (circa 100 mg).
2. Trasferimento del campione fecale di un tubo di 1,5 micro centrifuga con 1 ml di PBS e agitare vigorosamente.
3. Centrifugare per 10 min a 800 giri al minuto. Trasferire il supernatante in una provetta per microcentrifuga pulita.
4. Centrifugazione a 6000 rpm per 5 min. Sopranatante viene scartato e 200 ul PBS viene aggiunto al pellet e in agitazione.
5. Streak i 200 microlitri di PBS con una spatola cellulare usa e getta in un piatto BBL CHROMagar per rilevare Salmonella. Salmonella spp appaiono malva (rosa al viola, vedi Fig.1). Se 200 microlitri rendimenti troppe colonie sulla piastra, utilizzare 100 ul o 50 microlitri per la striscia.

4. Rappresentante dei risultati.

Quando il protocollo è fatto correttamente, Salmonella typhimurium colonizzazione può essere rilevato nell'intestino del mouse di oltre 6 mesi. Salmonella potrebbe essere rilevato dalla cultura fecali oltre 6 mesi (Fig.1). Come venire fuori tipico di questo modello, perdita di peso del corpo e la morte si verificano entro 4 settimane dopo l'infezione. A seconda del ceppi di Salmonella usati per l'infezione, alcuni topi potrebbe non sopravvivere più di 6 mesi.

Figura 1. Salmonella intestinale nella specie Salmonella appaiono malva (rosa al viola) a colori, a causa delle differenze metaboliche, in presenza di cromogeni selezionati. Altri batteri sono o inibiti o producono colonie blu-verde o incolore.

Figura 2. Proporzioni sopravvivenza dei topi infettati con il ceppo mutante di Salmonella PhoP ^{c, c} PhoP Avra-e PhoP AvrA-/AvrA + ^{c, c} PhoP Avra per 4 settimane (28 giorni).

Tabella 1. Il peso corporeo dei topi infettati da salmonella per 4 settimane.

* Rispetto al gruppo di controllo p <0,05
** Rispetto al gruppo di controllo p <0,01

Tabella 2. Ceppi di Salmonella utilizzato in questo studio.

Per utilizzare questo sistema, è necessario che il ricercatore per imparare a sonda gastrica degli animali. Noi dettaglio una metodologia per preparare la cultura batterica e sonda gastrica i topi. Mostriamo anche come monitorare la persistenza Salmonella nel tratto gastrointestinale (GI). Le fasi critiche in questo protocollo, tra cui:

1. Streptomicina-pretrattamento: Streptomicina-pretrattamento riusciva a liberarsi di qualche commensale della flora intestinale e fanno i topi suscettibili alla infezione da Salmonella ^2.
2. Salmonella sonda gastrica: per i principianti, la sonda gastrica potrebbe essere difficile. A volte, sonda gastrica non riesce perché la soluzione è accidentalmente iniettato per le vie respiratorie e causa la morte del mouse.
3. Persistente colonizzazione batterica: è necessario chiudere i batteri monitoraggio nel tratto GI. Oltre alla cultura del mouse fecale, i contenuti di cieco può anche essere utilizzato per il rilevamento di Salmonella nelle piastre BBL CHROMagar. Raccogliere i contenuti cieco quando i topi vengono sacrificati dopo l'infezione da Salmonella.

Abbiamo testato la colonizzazione Salmonella nel topo, a concentrazioni diverse: 1 x 10 ³ unità formanti colonie a 1 x 10 ⁸ unità formanti colonia (100 l / mouse). A 1 x 10 ⁶ a 10 x 10 ⁸ unità formanti colonie, Salmonella è stata in grado di colonizzare i topi. Pertanto, sulla base di nostre precedenti pubblicazioni ^{1, 5} e dati non pubblicati, la concentrazione finale di Salmonella in questa soluzione non sarà misurata prima sonda gastrica.

In questa procedura sperimentale, abbiamo utilizzato specifici-esenti da organismi patogeni C57BL femmina / 6 topi (Taconic, Hudson, NY) che sono stati 6-7 settimane di età. Ceppi batterici utilizzati includono Salmonella typhimurium wild-type ATCC14028s ceppo (WT-SL), non patogeni Salmonella ceppo mutante PhoP ^c3, PhoP ^Avra-c, e PhoP AvrA-/AvrA + ^{c, c} PhoP Avra (tabella 2). Usando questo protocollo, la colonizzazione Salmonella typhimurium possono essere rilevati a livello intestinale del mouse su 6 mesi (Fig. 1). Infezione da Salmonella e infiammazione sono stati misurati osservando materia fecale e peso ragazzo. Quando i campioni di tessuto e di sangue sono stati raccolti, la lunghezza dell'intestino è stata misurata come una caratteristica di infiammazione intestinale. I pesi di milza e fegato sono stati esaminati. Topo citochine siero sono stati testati da ELISA5. Altri metodi più, biochimici e molecolari sono inoltre utilizzati per verificare le modifiche di citochine infiammatorie e dei cambiamenti indotti dalla patologia Salmonella 5.

Di solito, perdita di peso corporeo e la morte si verificano entro 4 settimane dopo l'infezione (Tabella 1). Infezione da Salmonella post, vi era una significativa perdita di peso corporeo nei gruppi di batteri infetti rispetto al gruppo di controllo senza trattamento batterico (* p <0.05 o p <0,001 Tabella 1). Il peso corporeo è stato misurato ogni settimana. Le proporzioni di sopravvivenza 4 settimane dopo l'infezione sono stati mostrati in fig. 2. Complessivamente, il 92% dei topi (n = 50) infettati con ceppi di Salmonella PhoP ^c, il 78% PhoP Avra ^c-, o 70% PhoP ^c AvrA-/AvrA + può sopravvivere con Salmonella persistente nell'intestino. Dopo l'infezione acuta, tutti i sopravvissuti ancora iscritte Salmonella, che potrebbe essere rilevata un'infezione dopo 6 mesi usando il metodo descritto nella presente proposta. Una volta che i topi a sopravvivere 3 settimane dopo l'infezione, i topi guadagnato il peso corporeo e meno decesso (Fig.2). Inoltre, i dati colorazione immunofluroscence mostrano anche l'invasione di Salmonella in mucosa intestinale 27 settimane dopo l'infezione (Fig.3). Questi dati hanno mostrato che PhoP ^{c, c} PhoP Avra-o PhoP ^c AvrA-/AvrA + può essere utilizzato per il modello di infezione cronica.

I topi con fattore di ospitare resistenza Nramp1 + / + sono resistenti alla infezione da Salmonella ^3-6. C57/BL6 topi con Nramp difettose sono state utilizzare negli studi attuali. Abbiamo trovato che il 90% topi infettati con il ceppo di Salmonella 14028s patogeni non sopravvivono più di 4 settimane (dati non riportati). Per capire il effetti a lungo termine di tipo selvaggio infezione S. Typhimurium, i topi con Nampr1 + / + potrebbe essere usato.

Questo modello è stabilito in un BSL-2 di laboratorio. Il nostro protocollo è approvato dalla University of Rochester University commissione per le risorse animali (UCAR). Topi infettati con Salmonella sono probabilità di soffrire di disagio e sofferenza e diventano meno attivi e muoversi lentamente. La loro pelliccia può diventare arruffato e non possono mangimi o bevande come di consueto. Gli animali saranno osservati da vicino e se ogni segno di disagio, come incapace di deambulare abbastanza bene per mantenere l'idratazione e l'apporto calorico se un topo ha mostrato indicazione che aveva aspirato liquido o una significativa perdita di peso corporeo (10% o più) ^7, e non non muoiono immediatamente, il mouse è stato umanamente eutanasia. Tutto il personale di laboratorio saranno formati inOsservando i topi opportunamente ^{8, 9.}

Molti studi usato la streptomicina-pretrattamento hanno approfittato della colite indotta da Salmonella typhimurium per gli studi sulle nella fase precoce di infezione ^1,2,10. Tuttavia, solo pochi indicano l'infezione cronica nel modello murino in vivo ^11. I topi con l'esistenza di Salmonella persistente nel tratto GI ci permettono di esplorare a lungo termine di interazione ospite-batterico, trasduzione del segnale, e tumorigenesi. Abbiamo stabilito un modello batterica cronica del mouse infettati con Salmonella typhimurium colonizzazione nell'intestino del mouse di oltre 6 mesi. Questo modello può essere utilizzato anche per la patogenesi E.coli e studi di probiotici. Nel complesso, questo protocollo sarà di aiuto ricercatori che utilizzano il modello murino di affrontare le questioni biologiche e microbiologiche di fondamentale importanza.