Extrahieren von DNA aus dem Gut Mikroben der Termite (Zootermopsis Angusticollis) und visualisieren Gut Mikroben

Zusammenfassung des Verfahrens für die Termiten ganzen Darm DNA-Extraktion:

1. Gefühlt Termiten auf Eis zu entfernen gut mit einer sterilen Pinzette und stabilisieren gut Proben in Puffer.
2. Homogenisieren Proben in PVPP / SDS / Phenol-Puffer.
3. Extrahieren und zu reinigen DNA aus Rohlysat mit Qiagen DNeasy Spalten.

Protokoll:

1. Auf Eis, entfernen Sie die Eingeweide aus Arbeiter Kaste Termiten mit einer sterilen Pinzette.
2. Sofort überweisen Sie den Mut und die Inhalte in einen sterilen, Nuklease-freies Röhrchen mit 50 uL eiskaltem 1x Molekularbiologie TE-Puffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Freeze-Proben bei -20 ° C, oder gehen Sie direkt mit der Homogenisierung.
3. Übertragen Sie die gut Proben und Puffer, um eine sterile, Nuklease-freies 2 ml Schraube Röhrchen vorinstalliert mit 500 mg sterile Zirkonoxid / Silica-Kugeln (0,1 mm) und 700 ul 1x TE-Puffer mit 1% w / v Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP ).
4. Dann werden 50 ul 20% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 500 ul Phenol zu den Proben.
5. Homogenisieren (bead beat) auf die höchste Einstellung mit drei Zyklen von 30 sec homogenisiert und 30 sec von Kühlen auf Eis.
6. Sediment unlösliches Material für 1 min bei 8.000 x g.
7. Purify 300-ul Aliquots der wässrigen (oberste) Schicht mit Qiagen DNeasy Spalten mit der Methode für Rohlysat Reinigung beschrieben.
8. Quantify Nukleinsäure Inhalt und frieren die Proben bei -20 ° C für eine spätere Verwendung.

Nach unserer Erfahrung ist die DNA aus der mikrobiellen Lebensgemeinschaften von Holz-Fütterung Termitenart wie Zootermopis nevadensis extrahiert rein genug für die PCR-Vorlage nach einer Runde der Extraktion und Reinigung. Jedoch können einige Termiten, wie Wurf-Fütterung und Boden-Fütterung Arten haben eine höhere Konzentration an Huminsäuren in ihren Darminhalt und kann zusätzliche Reinigung des Darms mikrobielle DNA erfordern. Die gesamte DNA-Ausbeute aus dem Bauch von 5 Z. nevadensis Arbeiter liegt im Bereich von 10-30 pg. Für Termitenart deutlich kleiner oder größer als diese Art, können mehr oder weniger Proben erforderlich, um eine ähnliche Menge an DNA zu erhalten.

Diese Methode kann leicht angepasst, um die RNA-Extraktion zu ermöglichen. Für die RNA-Extraktion, Ersatz 1x RNAprotect Bakterien-Reagenz von Qiagen (CATLOG Nr. 76.506) für den eiskalten TE-Puffer in Schritt 2 des Protokolls beschrieben. Qiagen RNeasy Reagenzien und Spalten (CATLOG Nr. 74.104) sollten an die Stelle der DNeasy Reinigung oben beschriebene Verfahren verwendet werden. Als DNA kann aus RNAprotect-stabilisierten Proben gereinigt werden und nur 300 ul der rund. 700 ul wässrige Schicht in Schritt 7 abgerufen wird benötigt für die Aufreinigung von Nukleinsäuren, diese Methode verwendet werden, um sowohl DNA als auch RNA in parallel aus einer einzigen Probe abgerufen werden.

Diese Techniken sind abhängig von der Extraktion und Reinigung von hochwertigen Nukleinsäuren aus der Termitendarm Umwelt. Die Extraktion Technik in diesem Video beschrieben wird, eine modifizierte Zusammenstellung von Protokollen für die Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus Umweltproben (Moré et al, 1994 entwickelt;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) und sie produziert DNA von Termiten Enddarm Material für die Verwendung als Vorlage für die Polymerase Kettenreaktion (PCR).